ORFeome phage display to identify microbiome-derived biomarker candidates in the context of inflammatory disorders of the gut

Zantow, Jonas Max

Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen und chronisch entzündliche Erkrankungen können mit systemischen Antikörperreaktionen des Immunsystems assoziiert sein, wobei krankheitsspezifische Antikörper wichtige Biomarker darstellen können. Die Identifikation der Antigene, die diese spezifischen Immunantworten hervorrufen ist jedoch schwierig, vor allem wenn diese auf komplexe mikrobielle Gemeinschaften zurückgehen. Obwohl in der Diagnostik auf leistungsfähige Technologien zurückgegriffen werden kann, ist die Entdeckung neuer serologischer Marker schwierig, besonders bei steigender Komplexität durch mikrobielle Gemeinschaften. In dieser Arbeit wurde ORFeome Phagen Display angewendet um immunogene Proteine des Darmmikrobioms als potentielle Biomarker chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) zu identifizieren. Mittels transgener TNFdeltaARE/+ Mäuse mit chronischer Entzündung des Ileums (ähnlich zu Morbus Crohn) wurde gezeigt, dass die Technologie zur Identifikation Mikrobiom-bezogener Biomarker geeignet ist. Aus metagenomischer DNA des Caecum ileal entzündeter Mäuse wurden 3 individuelle Phagen Display Bibliotheken mit jeweils mehr als 10 Millionen unterschiedlicher Klone konstruiert. Erstmals wurde mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung gezeigt, dass die Bibliotheken eine substantielle Diversität aufweisen und für die Selektion von Biomarker-Kandidaten mit immobilisierten Serumantikörpern verwendet werden können. Es konnten 3 Oligopeptide identifiziert werden, die eine spezifische Antikörperantwort in entzündeten Mäusen hervorgerufen haben. Um die Technologie auf den Menschen zu übertragen, wurden Phagen Display Bibliotheken des Darmmetagenoms von Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa Patienten konstruiert. Es wurden mehrere Oligopeptide selektiert, die mit einer kleinen Kontrollgruppe als Biomarker Kandidaten validiert werden konnten. Bei der weiteren Charakterisierung der Kandidaten durch eine größere Kontrollgruppe konnte die krankheitsspezifische Antikörperreaktion jedoch nicht mehr bestätigt werden. Die größere Heterogenität humaner Kohorten im Vergleich zu Versuchstieren könnte dabei entscheidend gewesen sein, dass keine krankheitsspezifischen Marker identifiziert werden konnten. Dennoch wurde in dieser Arbeit erstmalig gezeigt, dass ganze Metagenome verwendet werden können, um mittels ORFeom Phagen Display Protein-Protein Interaktionen zu untersuchen und potentielle Biomarker zu identifizieren.

Pathogen infections, autoimmune diseases, and chronic inflammatory disorders are associated with systemic antibody responses from the host immune system. Disease-specific antibodies can be important serum biomarkers, but the identification of antigens associated with specific immune reactions is challenging, in particular if complex communities of microorganisms are responsible for the disease. Despite promising new diagnostic opportunities, the discovery of these serological markers is difficult and becomes even more challenging with increasing complexity of the microbial communities. In the present work, a metagenomic M13 phage display approach (ORFeome phage display) was used to identify novel gut microbiome-derived biomarker candidates in the disease context of inflammatory bowel disease (IBD). As a proof-of-concept, TNFdeltaARE/+ mice of Crohn’s-like experimental ileitis were used. Three individual metaproteome phage display libraries with a library size of approximately 107 clones each were constructed from the caecum of ileal inflamed mice. The libraries were analyzed by next generation sequencing revealing a substantial degree of diversity for oligopeptide selection. Using serum antibodies, three oligopeptides that induced specific antibody responses in inflamed mice were selected and validated. Translating the technology to human IBD, metaproteome phage display libraries were constructed from the gut microbiome of patients suffering from Crohn’s disease and ulcerative colitis. Several candidate oligopeptides were selected using patient sera and were initially validated on oligopeptide phage level with a small control cohort. But using a larger control cohort, it was not possible to confirm the selected immunogenic proteins being IBD-specific. Broader cohort heterogeneity of humans compared to a mouse model may have hampered the selection of specific biomarker candidates for human IBD. Nevertheless, the present work provides the first successful application of ORFeome phage display using a metaproteome approach for the study of protein-protein interactions and the discovery of potential disease biomarkers.

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Zantow, Jonas Max: ORFeome phage display to identify microbiome-derived biomarker candidates in the context of inflammatory disorders of the gut. 2016.

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