Functional analysis of W- and WT-boxes from the promoter of the WRKY30 gene in response to microbe-associated molecular pattern (MAMP)

Do, Xuan Dong

Pflanzen haben verschiedene Mechanismen um ihre angeborene Immunität gegenüber Pathogenangriffen zu entwickeln. Transkriptionsfaktoren (TF) spielen wichtige Rollen bei der Regulation essentieller Signalwegen für den Schutz der Pflanzen. Im Licht neuester Fortschritte in der Kombination von bioinformatischen und experimentellen Ansätzen wurden eine Vielzahl von DNA Bindungsmotiven für TFs in Genen entdeckt, die durch sogenannte Mikroben-assoziierte molekulare Muster (MAMPs) hochreguliert werden. Unter diesen 25 Elizitor-responsiven Sequenzen interagieren zwei cis-regulatorische Module (CRM1 und CRM2) aus dem Arabidopsis thaliana WRKY30 promotor mit WRKY70, einem Mitglied der größten Familie transkriptioneller Regulatoren in Pflanzen.Beide Module enthalten zwei W-Boxen (TGACC; TTGACC in CRM1 und TTGACT; TTGACT in CRM2) und eine WT-Box (GGACTTTC in CRM1 und TGACTTTT in CRM2). Um die Rolle dieser Module bei der MAMP Responsivität im Detail zu verstehen, wurde eine synthetisches Promotorsystem, kombiniert mit einem Mutationsansatz, in meiner Arbeit verwendet. Eine Deletionsanalyse des WRKY30Promotors in Petersilienprotoplasten zeigt dass CRM1 für die MAMP Responsivität wichtig ist, aber CRM2 alleine nicht ausreicht. Dieses Ergebnis stimmt mit Daten in Arabidopsis thaliana Protoplasten überein in denen nur CRM1 flg22 and AtPep1 Responsivität zeigen. Eine Mutationsanalyse der synthetischen Promotoren die CRM1 und CRM2 enthalten zeigt, dass die W- und WT-Boxennotwendig für die MAMP-responsive Genexpression in Petersilienprotoplasten sind.Dabei ist eine W-Box wichtiger wie die andere. Diese Ergebnisse zeigen dass mindestens zwei regulatorische Sequenzen für die volle MAMP Responsivität in CRM1 notwendig sind. Weitere Mutationsanalysen in Arabidopsisprotoplasten zeigen, dass die beiden W-Boxen und die WT-Box von CRM1 notwendig für die flg22 and AtPep1 Respoinsivität sind. Hefe One-Hybrid Screeningsmit beiden CRMs unter Verwendung einer 1500 TF cDNA (prey) Bibliothekselektieren hauptsächlich WRKY-Faktoren. Während CRM2 zufällig viele verschiedene WRKYs selektiert, selektiert CRM1 hauptsächlich WRKY26, 40, 41 und 70 durch deren Interaktion mit den W-Boxen in CRM1. In Pflanzenzellen fungieren WRKY40 and 41 als Repressoren der CRM1-responsiven Genexpression, wohingegen WRKY70 ein Aktivator ist. In Übereinstimmungmit früheren Studien zeigt meine Sudie in der Hefe, dass alle vier untersuchten WRKY Faktoren die klassischen W-Boxen in CRM1 binden können. Allerdings binden WRKY40 und WRKY70 nicht an die WT-Box, wohingegen WRKY26 and WRKY41 mit diesem Element von CRM1 zu interagieren scheinen. Diese Ergebnisse zeigen die Bedeutung der WT-Box in CRM1 als neue cis-regulatorische Sequenz für die MAMP-induzierte Genexpression die mindestens eine zweite cis-regulatorische Sequenz für die MAMP Responsivität benötigt.

Plants have various mechanisms to develop their innate immunity in response to pathogen attacks. Transcription factors (TF) play important roles in regulating essential pathways for the protection of plants. In light of recent advances in the combination of bioinformatic and experimental approaches, a diversity of DNA binding motifs for TFs were discovered in genes strongly upregulated by microbe-associated molecular patterns (MAMPs). Amongst these 25 elicitor-responsive sequences, two cis-regulatory modules (CRM1 and CRM2) from the Arabidopsis thaliana WRKY30 promoter were previously demonstrated to interact with WRKY70, one member of the largest family of transcriptional regulators in plants. Both modules harbour two W-boxes (TGACC; TTGACC in CRM1 and TTGACT; TTGACT in CRM2) and one WT-box (GGACTTTC in CRM1 and TGACTTTT in CRM2). To understand the role of these modules in the MAMP response in detail, a synthetic promoter system combined with a mutation approach was used in my study. Deletion analysis of the WRKY30 promoter in parsley protoplasts shows that CRM1 is important for MAMP responsivity but CRM2 alone is not sufficient. This result is consistent with data in Arabidopsis thaliana protoplats where only CRM1 shows flg22 and AtPep1 responsivity. Mutation analysis of the synthetic promoters harbouring CRM1 or CRM2 reveals that the W- and WT-boxes are necessary for MAMP-responsive gene expression in parsley protoplasts, of which one W-box is more important than the other. The results show that at least two regulatory sites are required for full MAMP responsivity in the CRM1. Further mutation analysis in Arabidopsis protoplasts shows the requirement of the two W-boxes and the WT-box of the CRM1 for flg22 and AtPep1 responsivity. Yeast one-hybrid screenings using both CRMs with a 1,500 transcription factors (TFs) only prey library select mainly WRKY-factors. While CRM2 randomly selects a wide array of different WRKYs, CRM1 predominantly selects WRKY26, 40, 41 and 70 by their interaction with the W-boxes in CRM1. In plant cells WRKY40 and 41 act as repressors of CRM1-responsive gene expression while WRKY70 is an activator. In agreement with previous studies, my study shows that in yeast, all of four investigated WRKY factors could bind to the classical W-boxes of CRM1. However, WRKY40 and WRKY70 do not bind to the WT-box whereas WRKY26 and WRKY41 seem to interact with this element of CRM1. These results demonstrate the importance of the WT-box of CRM1 as a new cis-regulatory sequence for MAMP-induced gene expression requiring at least a second cis-regulatory sequence for MAMP responsivity.

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Do, Xuan Dong: Functional analysis of W- and WT-boxes from the promoter of the WRKY30 gene in response to microbe-associated molecular pattern (MAMP). 2016.

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