Modularisierung von Glykosyltransferasen und Untersuchungen zum Aktivitätsnachweis im Hochdurchsatzverfahren

Gumz, Malte

Glykosyltransferasen (GT) katalysieren die Kondensation zwischen einem Zucker und einem weiteren Zuckermolekül oder einem Aglykon. Die Enzyme der Superfamilie GT-A und GT-B besitzen zwei Domänen, die durch eine Linker-Region (LR) miteinander verbunden sind. Die eine Domäne bindet den Zuckerdonor, die zweite Domäne bindet den Zuckerakzeptor. Aus dieser Struktur ergibt sich die Möglichkeit die Domänen verschiedener GT miteinander zu kombinieren, um Enzyme mit neuer Reaktivität zu erzeugen. Ziel der Arbeit war die Kombination der Zuckerakzeptor-Domäne der Hydrochinon-Glucosyltransferase (AS) mit geringer Substratspezifität und der Zuckerdonor-Domäne der Kämpferol-3-O-Galactosyltransferase (GalT) mit hoher Substratspezifität. Hierzu sollte eine Gen-Bibliothek chimärer GT erstellt werden. Der Aktivitätsnachweis sollte im Hochdurchsatz (HTS) etabliert werden. Für die Herstellung einer Gen-Bibliothek für chimäre GT mit definierten FP in der LR wurde die One-pot fusion-PCR entwickelt. Die Methode ITCHY wurde verwendet, um eine Bibliothek chimärer Gene mit zufälligen FP in der LR zu generieren. Alle Konstrukte wurden in E. coli exprimiert. Der Aktivitätsnachweis der heterolog exprimierten Ausgangsenzyme wurde geführt, indem die gebildeten Glykoside mittels HPLC-DAD nachgewiesen wurden. Die Reaktionsbedingungen wurden vereinheitlicht und es wurde gezeigt, dass beide Enzyme unter identischen Bedingungen analysiert werden können. Für den Nachweis im HTS wurde die mit der Glykosylierung verbundene Protonenfreisetzung mit einem pH-Indikator verfolgt. Keines der untersuchten Verfahren erwies sich für das HTS als verlässlich genug. Daher wurde für die AS eine HPLC-ESI-MS/MS-Methode zum Nachweis von p-Arbutin erarbeitet, welche auf Extrakte von E. coli mit chimären Konstrukten übertragen wurde. Die Identifizierung einer aktiven chimären GT gelang nicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die ICHTY-Technik eine zeitsparende Methode zur Erzeugung einer Gen-Bibliothek für chimäre GT darstellt. Um aktive Chimäre zu erzeugen, muss die Methode so optimiert werden, dass mehr chimäre Konstrukte entstehen, deren LR eine ähnliche Größe besitzt wie die LR der Ausgangsgene. Der pH-basierte Aktivitätsnachweis ist prinzipiell im HTS möglich, führt aber oft zu falsch-positiven Ergebnissen. Der spezifische Produktnachweis mittels HPLC-DAD und HPLC-ESI-MS/MS erscheint auf der Basis der vorliegenden Untersuchungen die Methode der Wahl für die Aktivitätsbestimmung im HTS zu sein.

Glycosyltransferases (GT) catalyze the condensation between a sugar and another sugar molecule or an aglycone. Enzymes of the superfamilies GT-A and GT-B possess two domains which are connected by a linker-region. One domain binds the sugar donor, the other domain binds the sugar acceptor. This structure opens the possibility to combine domains of different GTs to obtain enzymes with new reactivities. This study was aimed at combining the sugar acceptor-domain of hydroquinone-glucosyltransferase with low substrate specificity with the sugar donor-domain of kaempferol-3-O-galactosyltransferase with high substrate specificity. Therefor a gene library for chimeric GTs had to be generated. To identify active chimeric GTs a high-throughput screening (HTS) had to be established. In order to obtain gene constructs for chimeric GTs with a defined fusion site within the linker-region, the One-pot fusion-PCR was developed. The ITCHY technique was applied to generate a library of chimeric genes with random fusion sites within the linker region. All constructs were expressed in E. coli. Enzyme activity was first shown for the heterologously expressed wildtype enzymes by HPLC-DAD detection of glycosides produced in enzyme assays. Reaction conditions were then unified and it was demonstrated that both enzymes can be analyzed with identical reaction conditions. For HTS, proton release during glycosylation was monitored by means of a pH- indicator. However, the method was not reliable enough to be used in HTS. Therefore, an HPLC-ESI-MS/MS method was established for the detection of the hydroquinone-glucosyltransferase product p-arbutin. This method was applied to screen crude extracts of E. coli containing chimeric constructs. However, no active chimeric GTs were identified. The results of this study show that ITCHY is a time-saving method to create a gene library for chimeric GTs. In order to obtain an active chimera, this method has to be improved to obtain more chimeras with a linker-region of similar length as found in the parental GTs. Although the pH-based assay seemed to be principally applicable, the number of false-positive results was too high for use in HTS. Glycoside detection by HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS/MS is characterized by high sensitivity and correct assignment of samples with active enzyme. HPLC-ESI-MS/MS appears to be the most suitable method for high-throughput screening to identify active chimeric GTs based on this study.

Zitieren

Zitierform:

Gumz, Malte: Modularisierung von Glykosyltransferasen und Untersuchungen zum Aktivitätsnachweis im Hochdurchsatzverfahren. 2016.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export