Regulation of respiratory pathways for the energy generation in D. shibae under nitrate respiratory conditions

Laaß, Sebastian

Dinoroseobacter shibae ist ein Meeresbakterium, das zu den ubiquitär zu findenden Roseobacter Cluster gehört. Die Untersuchung des sequenziertem Genoms identifizierte Gene, die für Enzyme des anaeroben Metabolismus codieren. 7 Crp/Fnr ähnliche Transkriptionsregulatoren annotiert, was die Frage nach dem genregulatorischem, proteomischem und metabolomischem Netzwerk aufwirft, das die Anpassung von aeroben zu anaeroben Wachstumsbedingungen kontrolliert. Daher wurde in dieser Arbeit zunächst eine kontinuierliche Kultivierung von Dinoroseobacter shibae im Chemostaten unter aeroben Bedingungen in Minimalmedium etabliert. Zeitaufgelöste Shift Experimente von oxischen zu nitratrespiratorischen Wachstumsbedingungen wurden zur Charakterisierung der Anpassung von D. shibae auf transkriptioneller, translationeller und metabolischer Ebene durchgeführt. Die Transkriptom- und Proteomdaten zeigten eine starke Expression der Operons, die für Proteine der Denitrifikation codieren. Weiterhin wurde die Expression von Genen, die für die Proteine der Crp/Fnr Familie dnrD, dnrE und dnrF codieren, auch induziert vorgefunden, was zu der Annahme führt, dass diese in das regulatorische Netzwerk der Adaption an Nitratrespiratorische Bedingungen beteiligt sind. Durch eine bioinformatische Stammbaumanalyse konnten DnrD, DnrE und DnrF in die Unterfamilie Dnr klassifiziert werden. Vergleichende DNA Microarray Experimente des Wildtyps und einer dnrF Deletionsmutante zeigten einen zumeist reprimierenden Einfluss von DnrF auf die Expression verschiedener Gene, codierend für Energiegewinnung, Transkriptionsfaktoren und Eisen-Schwefel Cluster Proteinen unter aeroben und anaeroben Bedingungen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass DnrF meist als Sauerstoff unabhängiger Repressor fungiert. Zur Identifizierung von essentiellen Genen, die in D. shibae für das Wachstum unter Nitratrespiratorischen Bedingungen benötigt werden, wurde eine Transposonmutagenese etabliert. Über 4500 Mutanten wurden nach Wachstumsversuche untersucht. Hier zeigten 53 Mutanten ein geringeres oder kein Wachstum. Essentiell für das Wachstum wurden z. B. die Gene, die für die periplasmatische Nitratreduktase NapA und das Molybdopterin Biosynthese Protein MoeB identifiziert. Im Vergleich mit dem Transkriptom und Proteom von D. shibae wurden nur 3 Gene (napA, phaA and the Na+/Pi antiporter gene Dshi_0543) identifiziert, die sowohl essentiell als auch induziert unter diesen Bedingungen sind.

Dinoroseobacter shibae is a marine bacterium and belongs to the ubiquitously found Roseobacter clade. Investigation of the genome sequence identified genes encoding enzymes of the anaerobic metabolism. 7 Crp/Fnr like regulators were annotated, which leads to the question for the gene regulatory network, proteomic and metabolomic networks controlling the transition between aerobic and anaerobic growth. To answer this question, an aerobic continuously cultivation of D. shibae in a chemostate in minimal media supplemented with was established. Time resolved shift experiments from oxic to anoxic growth conditions were performed to characterize the transcriptomic, proteomic and metabolomic adaptation of D. shibae. The transcriptome and proteome data revealed a strong expression of operons encoding proteins for the formation of the denitrification machinery. Furthermore, the expression of the genes encoding the Crp/Fnr like regulators dnrD, dnrE and dnrF was also found increased, which leads to the assumption of involvement in the regulatory network for the establishment of nitrate respiratory conditions. Moreover, the synthesis of PHB was observed under these conditions and verified by transmission electronic microscopy and HPLC analyses. Using a bioinformatics approach the phylogenetic affiliation of DnrE, DnrD and DnrF into the various subfamily of Crp/Fnr like regulators was achieved. Furthermore, comparative transcriptome analyses of wildtype and dnrF deletion mutant revealed the mainly repressing influence of DnrF on several genes encoding for enzymes of the energy generation machinery, transcription factors and iron-sulfur cluster proteins under oxic and anoxic conditions. This leads to the consumption of DnrF acts mainly as a oxygen independent repressor. To identify the essential genes of D. shibae for growth under nitrate respiratory conditions a transposon mutagenesis approach was established. Over 4500 mutants were screened for a growth failure under these conditions. Finally, 53 strains showed a growth defect or even no growth. Genes encoding the periplasmic nitrate reductase NapA and the molybdopterin biosynthesis protein MoeB were found to be essential. In comparison with the transcriptomic and proteomic profile of D. shibae only 3 genes (napA, phaA and the Na+/Pi antiporter gene Dshi_0543) showed an overlap of induced and essential. Furthermore, highly induced genes (nirS) are not essential for the growth under nitrate respiratory conditions.

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Laaß, Sebastian: Regulation of respiratory pathways for the energy generation in D. shibae under nitrate respiratory conditions. 2016.

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