Generierung, Validierung und Charakterisierung einer naiven single chain Fab Bibliothek

Tomszak, Florian

Aus Antikörpergenbibliotheken wurden in der Vergangenheit monoklonale Antikörper für Therapie und Diagnostik generiert. Unterschiedliche Displaymethoden wurden hierfür verwendet. Eine etablierte Methode ist das Antikörperphagendisplay. Bei dieser werden Antikörperfragmente an Phagenoberflächenproteine fusioniert und ermöglichen so die Selektion spezifischer Binder gegen Antigene. Weit verbreitet bei dieser Anwendung ist das scFv und das Fab Fragment. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es ein neues Antikörperformat für Antikörpergenbibliotheken zu testen: Das single chain Fab (scFab) Fragment. Hierfür wurde zunächst Spendern Blut entnommen, die Lymphozyten isoliert und die Antikörper kodierenden Bereiche durch PCR amplifiziert. Es folgte die Klonierung in Phagemide und die Produktion von Antikörperphagen. Im Anschluss wurde die generierte Bibliothek auf unterschiedlichen Antigenen getestet. In etwa 200 Selektionen war es nur möglich einen Binder zu selektieren, dessen spezifische Bindung an das Antigen JNK2 durch unterschiedliche Experimente validiert werden konnte. Daraufhin wurde im Weiteren untersucht, wie die Selektion verbessert werden kann. Dazu wurde die Produktion von Antikörpern, das Screening, die Selektion sowie das Format näher untersucht. Aggregation oder falsche Faltung von scFabs ließen darauf schließen, dass keine erfolgreiche Selektion unter den gewählten Bedingungen möglich ist.

In the past antibody gene libraries were used for the selection of monoclonal antibodies for therapy and diagnostic. Different display methods were used. One well established method is antibody phage display. Antibody fragments are fused to phage surface proteins which enables the selection of specific binders against antigens. The usage of scFv and Fab fragments is widely spread for this kind of method. Aim of this project was the establishment of a new antibody format, the single chain fab (scFab) format, for compatibility with antibody phage display. At first, donor blood was taken to isolate lymphocytes and the isolation of antibody coding regions by PCR. Afterwards fragments were cloned into phagemids and antibody phage were produced. Following, the generated antibody library was tested on various antigens In approximately 200 selections it was only possible to select one binder, with a well- validated specificity against the antigen JNK2. Thereupon analysis for better selection process was done. Antibody production, screening, selection and scFab format was analyzed in detail. Aggregation or misfolding of scFabs might be the reason for non-successful selection under used conditions.

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Tomszak, Florian: Generierung, Validierung und Charakterisierung einer naiven single chain Fab Bibliothek. 2015.

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