Pathogenic camouflage as defense mechanism against autophagic recognition

Leupold, Stefan

Die Erkennung von S. flexneri durch das Autophagiesystem basiert auf der Erkennung des bakteriellen Oberflächenproteins VirG durch das menschliche Protein ATG5. Als Gegenmaßnahme sekretieren Shigellen das Protein IcsB, welches kompetitiv und mit höherer Affinität an VirG bindet. Dadurch wird die Erkennung von VirG durch ATG5 verhindert, was den Tarnmechanismus von Shigellen ausmacht. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung dieses Tarnmechanismus durch Methoden der Strukturbiologie und Biochemie. Das ESPRIT System wurde genutzt, um nach löslichen Konstrukten der VirG α-Domäne zu suchen. Eines der resultierenden Konstrukte war VirGE76 (340-758), welches den Großteil der IcsB/ATG5 Bindedomäne abdeckte. Es konnte löslich exprimiert werden und wurde in Interaktionsstudien verwendet, kristallisierte jedoch nicht. VirGE94 (419-758) war ein weiteres Konstrukt, welches die letzten 15 Aminosäuren der IcsB/ATG5 Bindedomäne beinhaltete. Es wurde kristallisiert und seine Struktur wurde durch Röntgenkristallografie gelöst. Die VirGE94 Struktur enthielt eine bisher unbekannte Domäne, die N-terminal auf der β-Helix lokalisiert war. Die Faltung dieser Domäne ähnelte der Faltung von Autochaperondomänen verschiedener Autotransporterproteine. Ihre Funktion könnte daher die einer zweiten Autochaperondomäne sein, welche den Keim für eine Fortsetzung der β-Helix bildet. IcsB konnte nicht kristallisiert werden, jedoch wurde die IpgA Bindestelle von IcsB zwischen aa 26-125 lokalisiert, im Gegensatz zur vorher publizierten Bindestelle zwischen 171-247. Weiterhin wurden Hinweise auf eine Interaktion zwischen IcsB und N-WASP gefunden. Die Kristallstruktur von humanem ATG5 wurde gelöst. Sie zeigte zwei Ubiquitin-artig gefaltete Domänen und eine Region mit α-helikalen Bündeln. Die Phosphorylierung von ATG5 T75 hat einen inhibitorischen Effekt auf die Autophagie, dessen molekulare Mechanismen untersucht wurden, indem die Struktur der phosphomimetischen Mutante T75E gelöst wurde. Es konnten jedoch keine strukturellen oder biochemischen Unterschiede zwischen den ATG5 Varianten festgestellt werden. In Interaktionsstudien zwischen den drei am Shigella Tarnmechanismus beteiligten Proteinen, wurden Indizien für eine direkte Interaktion zwischen IcsB und VirGE76 gefunden, jedoch wurde keine Interaktion zwischen ATG5 und einem VirG-Konstrukt beobachtet.

Autophagic recognition of S. flexneri is based on the recognition of the bacterial surface protein VirG by the human protein ATG5. As a countermeasure S. flexneri secretes the protein IcsB which binds competitively and with higher affinity to VirG. Hence, recognition of VirG by ATG5 is blocked, thus masking S. flexneri from the autophagic system. The objective of this work was the characterization of this camouflage mechanism by structural biology and biochemistry methods. The ESPRIT system was deployed to screen for soluble constructs of the VirG α-domain. One of the resulting constructs was VirGE76 (340-758) that covered most of the IcsB/ATG5 binding domain. It was expressed solubly and was used in interaction studies but did not crystallize. VirGE94 (419-758) was another construct that covered the last 15 aa of the IcsB/ATG5 binding domain. It was crystallized and its structure was solved by X-ray crystallography. The VirGE94 structure contained a previously unknown domain that resided N-terminal on the β-helix. It had a fold similar to the autochaperone domains of different autotransporter proteins which indicated that it might act as a second autochaperone domain nucleating the fold of a continuation of the β-helix. IcsB could not be crystallized, but the IpgA binding site was mapped to IcsB residues 26-125, in contrast to the previously published binding site between residues 171-247. Furthermore, indications for an interaction of IcsB and N-WASP were observed. The crystal structure of individual human ATG5 was solved and showed two ubiquitin-like fold domains and an α-helical bundle region. ATG5 T75 phosphorylation had been shown to inhibit autophagy. Here the molecular mechanisms have been investigated by the crystallization of the phosphomimetic mutant T75E. However, no differences in the structural or biochemical properties of the different ATG5 variants were observed. Interaction studies between the three proteins involved in the Shigella camouflage mechanism showed indications for a direct interaction between IcsB and VirGE76, but no interaction between ATG5 and any VirG-construct was observed.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Leupold, Stefan: Pathogenic camouflage as defense mechanism against autophagic recognition. 2016.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export