Structural and biochemical investigations of the late enzymes of (bacterio)chlorophyll a biosynthesis

Lange, Christiane

Bei der (Bacterio)chlorophyll-Biosynthese katalysiert das Enzym DPOR die stereospezifische, ATP-abhängige Reduktion des D-Rings des Tetrapyrrol-Grundgerüsts. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die dreidimensionale Kristallstruktur des substrat- und MgADP•AlF3-gebundenen oktameren DPOR-Komplexes aus Prochlorococcus marinus mittels Röntgenstrukturanalyse mit einer finalen Auflösung von 2,6 Å bestimmt. Der DPOR Komplex, bestehend aus den Subkomplexen L2 und (NB)2, zeigte eine ausgeprägte strukturelle Homologie zum verwandten Nitrogenase-Komplex. Ein Vergleich des MgADP•AlF3-gebundenen L2 mit Strukturen des NifH2-Dimers wies auf einen eng verwandten nukleotidabhängigen Switch-Mechanismus von DPOR und Nitrogenase hin. Ein Vergleich verschiedener L2-Strukturen zeigte eine nukleotidabhängige Konformationsumwandlung des Dimers, die hauptsächlich durch wichtige Aminosäurereste an der Dimer-Kontaktfläche bewirkt wird. Des Weiteren zeigte sich, dass sich die Kontaktflächen von L2 und NB und jene der Nitrogenase-Subkomplexe NifH2 und NifD/NifK unterscheiden. Die DPOR-Untereinheit N scheint in ihrer räumlichen Anordnung der Nitrogenase-Untereinheit NifK und B der Untereinheit NifD zu entsprechen. Im DPOR-Komplex sind drei polare Aminosäuren und zwei Wassermoleküle um das Substrat Pchlide angeordnet. Basierend auf dieser Anordnung und den Ergebnissen von Mutagenesestudien wurde ein Protonierungsmechanismus für das C18-Atom mit Hilfe eines Wassermoleküls vorgeschlagen, welches von His-394 und der Propionat-Seitenkette am C17 des Substrats positioniert wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die rekombinant produzierten Enzyme BchF und BchC aus Chlorobaculum tepidum charakterisiert. Bioinformatische Analysen und Lokalisationsexperimente wiesen auf BchF als Transmembranprotein hin. BchC konnte hingegen als lösliches Protein gereinigt werden. In einem Aktivitätstest katalysierte BchC die NAD(H)-abhängige Umwandlung von artifiziellen, chemisch modifizierten Bacteriochlorin- und Chlorinderivaten mit 3(1)-OH- und 3-Acetyl-Substituenten. Ein gekoppelter DPOR-BchF-BchC-Aktivitätstest konnte etabliert werden, in dem das BchF-Produkt 3(1)-OH-Chlide und das BchC-Produkt 3-Acetyl-Chlide beobachtet wurden. Die Detektion dieser Pigmente wies auf einen möglichen neuen Reaktionsweg bei der BChl a-Biosynthese hin. Außerdem konnte BchC als eine zinkunabhängige Oxidoreduktase mit den katalytisch essentiellen Aminosäureresten Glu-46, Tyr-67, Glu-68 und His-141 charakterisiert werden.

During (bacterio)chlorophyll biosynthesis, the enzyme DPOR catalyzes the stereospecific two-electron reduction of the tetrapyrrole D ring in an ATP-dependent manner. In the first part of this work, the three-dimensional structure of the substrate-bound octameric DPOR complex from Prochlorococcus marinus, stabilized by the presence of the ATP analog MgADP•AlF3, was determined by X-ray crystallography with the final resolution of 2.6 Å. The DPOR complex, comprised of two L2 and one (NB)2 subcomplex, revealed a high degree of structural homology to the related nitrogenase complex. Comparison of MgADP•AlF3-bound L2 with structures of the NifH2 dimer indicated a closely related nucleotide-dependent switch mechanisms of DPOR and nitrogenase. Comparative analyses of L2 structures revealed a nucleotide-dependent conformational change of L2, mainly triggered by critical amino acid residues at the dimer interface. Furthermore, the model of the octameric complex showed that the docking interfaces of L2 and NB and the respective nitrogenase subcomplexes NifH2 and NifD/NifK differ with regard to the nature of the involved amino acids and secondary structure elements. Subunit N rather seems to correspond to NifK and B to NifD with regard to the spatial position relative to L2 or NifH2. In the DPOR complex, three polar amino acid residues and two water molecules are located around the substrate Pchlide. Based on this structural arrangement and due to mutational studies, a C18 protonation mechanism via a water molecule, positioned by His-394 and the C17 propionate side chain of Pchlide, is suggested. In the second part of this work, the recombinantly produced enzymes BchF and BchC from Chlorobaculum tepidum were characterized. Bioinformatics and localization analyses indicated that BchF is a transmembrane protein, whereas BchC was purified from the soluble cell fraction. In an activity assay, BchC catalyzed the NAD(H)-dependent conversion of artificial, chemically modified bacteriochlorin and chlorin derivatives with 3(1)-OH and 3-acetyl substituents. Moreover, a coupled activity assay comprising DPOR, BchF and BchC was established, revealing the presence of the BchF product 3(1)-OH-Chlide and the BchC product 3-acetyl-Chlide. The detection of the two pigments indicated a new reaction sequence for BChl a biosynthesis. Furthermore, BchC was shown to be a zinc-independent oxidoreductase with the catalytically crucial residues Glu-46, Tyr-67, Glu-68 and His-141.

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Lange, Christiane: Structural and biochemical investigations of the late enzymes of (bacterio)chlorophyll a biosynthesis. 2016.

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