Chlorophyllid a Oxidoreduktase aus Roseobacter denitrificans

Kiesel, Svenja

Im Rahmen der Bakteriochlorophyll a Biosynthese wird die stereo- und regiospezifische Reduktion der C-7/C-8-Doppelbindung von Chlorophyllid a durch die Chlorophyllid a Oxidoreduktase (COR) katalysiert. Die drei COR-Untereinheiten BchX, BchY und BchZ besitzen eine deutliche Aminosäure-Sequenzhomologie zu den entsprechenden Untereinheiten der Nitrogenase und der Licht-unabhängigen Protochlorophyllid a Oxidoreduktase (DPOR). Die DPOR katalysiert die Reduktion der C-17/C-18-Doppelbindung von Protochlorophyllid a. Chlorophyllid a wird durch die Übertragung von zwei Elektronen über zwei Redox-aktive [Fe-S]-Cluster reduziert. Mit Hilfe von Elektronenspinresonanz (EPR)-Spektroskopie wurde für (BchX)2 ein [4Fe-4S]-Cluster nachgewiesen. Mit Hilfe der Gelpermeationschromatographie konnte die heterotetramere Struktur von (BchY/BchZ)2 gezeigt werden. Mittels EPR-Spektroskopie konnten für (BchY/BchZ)2 zwei [4Fe-4S]-Cluster nachgewiesen werden. Durch ortsgerichtete Mutagenese-Experimente in Kombination mit Aktivitätstestuntersuchungen und EPR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass der [4Fe-4S]-Cluster von (BchY/BchZ)2 durch vier Cystein-Liganden koordiniert wird. Somit unterscheidet sich die COR von der homologen DPOR, welche drei Cystein- und einen Aspartat-Liganden für die Ausbildung eines [4Fe-4S]-Clusters besitzt. In weiteren Mutageneseexperimenten wurde das Liganden-Muster der DPOR auf (BchY/BchZ)2 übertragen. Die entsprechende COR-Doppelmutante zeigte zwar keinerlei enzymatische Aktivität, mittels EPR konnte jedoch die Ausbildung eines artifiziellen [4Fe-4S]-Clusters in Gegenwart eines Aspartat-Liganden nachgewiesen werden. Das unterschiedliche Liganden-Muster der DPOR und COR ist möglichweise verantwortlich für das spezifische Redox-Potential der entsprechenden Redox-aktiven [4Fe-4S]-Cluster. In der vorliegenden Arbeit wurde der ternäre COR-Enzymkomplex, (BchX)2(BchY/BchZ)2(BchX)2, in Anwesenheit des ATP-Analogons, MgADP·AlF4¯ detektiert. MgADP·AlF4¯ ist in der Lage den Übergangszustand der ATP-Hydrolyse nachzuahmen. Somit besitzt die COR vermutlich einen ähnlichen katalytischen Reaktionsmechanismus wie die DPOR. Dabei werden vermutlich unter ATP-Verbrauch die Elektronen über den [4Fe-4S]-Cluster der (BchX)2-Untereinheit über den [4Fe-4S]-Cluster der (BchY/BchZ)2-Untereinheit auf das Substrat übertragen. (BchX)2 nutzt dabei möglicherweise einen Nukleotid-abhängigen "Switch"-Mechanismus für die transiente Ausbildung des ternären Proteinkomplexes.

During Bacteriochlorophyll a biosynthesis the stereo- and regiospecific reduction of the C-7/C-8 double bond of chlorophyllide a is catalyzed by the chlorophyllide a oxidoreductase (COR). The three COR subunits BchX, BchY and BchZ share a high degree of amino acid sequence homology to nitrogenase and to light-independant protochlorophyllide a oxidoreductase (DPOR). DPOR catalyzes the reduction of the C-17/C-18 double bond of protochlorophyllide a. Chlorophyllide a is reduced by the transfer of two electrons via the redox-active iron-sulfur-clusters of COR. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) revealed a [4Fe-4S] cluster for the (BchX)2 homodimer. Gel permeation chromatography experiments indicated the heterotetrameric structure of the (BchY/BchZ)2 subkomplex. EPR spectroscopy revealed two [4Fe-4S] clusters on the (BchY/BchZ)2 subunit. Site-directed mutagenesis experiments in combination with a coupled in vitro activity assay and EPR spectroscopy indicated that the [4Fe-4S]-cluster of (BchY/BchZ)2 is coordinated by four cysteine ligands. Therefore, COR differs from closely related DPOR, in which the cluster is ligated by three cysteins and one aspartate. In following mutagenesis experiments a DPOR-like ligation pattern was implemented for (BchY/BchZ)2. The appropriate COR double mutant did not show any enzymatic activtiy, but EPR revealed an artificial [4Fe-4S] cluster. The different ligation pattern of DPOR and COR might be responsible for the specific redox potential of the [4Fe-4S] clusters in the respective enzyme-complexes. In this study the ternary COR complex, (BchX)2(BchY/BchZ)2(BchX)2, was detected in the presence of the ATP analog MgADP·AlF4¯ resembling the transition state of ATP hydrolysis. Therefore, a COR reaction mechanism in analogy to the catalytic reaction mechanism of DPOR was proposed. Individual electrons are transfered via the [4Fe-4S] cluster of (BchX)2 onto the [4Fe-4S] cluster of (BchY/BchZ)2 on the substrate. A nucleotide-dependent switch mechanism of (BchX)2 was proposed.

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Kiesel, Svenja: Chlorophyllid a Oxidoreduktase aus Roseobacter denitrificans. 2016.

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