Phänotypische Charakterisierung des Membran-assoziierten Virulenzfaktors Mip von Legionella pneumophila

Rasch, Janine

Das Umweltbakterium Legionella pneumophila repliziert sich fakultativ intrazellulär in Protozoen, sowie in humanen alveolaren Makrophagen. Dies hat die Schädigung des Lungengewebes und zum Ausbruch einer Legionellose zur Folge. Der Kollagen IV-bindende Virulenzfaktor Mip ist wichtig für die intrazelluläre Replikation der Legionellen und für die Meerschweinchen-Infektion. Dieses Protein besitzt eine Peptidylprolyl cis/trans Isomeraseaktivität (PPIase), ein natürliches Substrat wurde aber bisher nicht gefunden. Trotz Identifizierung einiger Phänotypen blieb die Rolle von Mip in der Infektion bis dato ungeklärt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zunächst neue Mip-abhängige Phänotypen in L. pneumophila aufgedeckt. Entsprechend konnte die Relevanz von Mip für die Vermehrung, die Verbreitung und die Schädigung in humanem, explantiertem Lungengewebe (HLTE) gezeigt werden. Sekretomanalysen zeigten, dass im zellfreien Kulturüberstand der mip-Deletionsmutante viele Proteine akkumuliert vorlagen. Eines dieser Proteine, LpC_2560 (Mrf), konnte als neuer Mip-abhängiger Virulenzfaktor charakterisiert werden. Desweiteren wurde eine weitere PPIase, das Cyclophilin PpiB, für eine Charakterisierung ausgewählt. Deletionsmutanten beider PPIasen hatten ein vermindertes Wachstum bei niedrigen und hohen Temperaturen zur Folge. Außerdem wiesen sie eine verminderte Sliding Motility und intrazelluläre Replikation in A. castellanii, Makrophagen und HLTEs auf. Eine doppelte Deletionsmutante zeigte sogar oft einen verstärkten Phänotyp, was auf eine Kompensation der PPIase-Aktivität der beiden Proteine untereinander schließen lässt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss von neuartigen Cycloheximid-Derivaten auf das Wachstum und die Mip-abhängige Replikation von L. pneumophila untersucht. Einige Substanzen hatten einen inhibitorischen Effekt auf das Wachstum und intrazelluläre Replikation von L. pneumophila, dieser war allerdings Mip-unabhängig. Im dritten Teil der Arbeit wurde die Relevanz von Mip für die Verbreitung von Legionellen in der Umwelt analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass markierte Legionellen in einem natürlichen Biofilm diverse Protozoen und den Darm einer aquatischen Nematodenspezies besiedeln können. Die Relevanz von Mip für die Besiedlung des Verdauungstraktes von Nematoden wurde anhand des Modellorganismus Caenorhabditis elegans charakterisiert, wo das Fehlen von Mip zu einem verzögerten Median der Letalität und einer geringeren Besiedlungsrate führte.

Legionella pneumophila is an environmental bacterium, which replicates intracellularly within protozoa and human alveolar macrophages, destroying the lung tissue and resulting in Legionnaire’s disease. The collagen IV binding virulence factor Mip is important for the intracellular replication of L. pneumophila in macrophages, amoeba and guinea pigs. The only identified function of this protein is a peptidylprolyl cis/trans isomerase activity (PPIase), but until now no natural substrate has been found. Despite the identification of several phenotypes the role of Mip in infection is still unclear. In the first part of this thesis new Mip-dependent phenotypes of L. pneumophila were identified, to clarify the specific function of Mip as a virulence factor. Accordingly, the relevance of Mip for the multiplication and dissemination in human lung tissue explants (HLTEs) as well as their destruction were shown. Secretome analyses showed that many proteins were found to be accumulated in the cell free culture supernatant of the Mip-negative strain. One of this proteins, LpC_2560 (Mrf), could be identified as a novel Mip-dependent virulence factor. Further on, another Legionella PPIase, the cyclophilin PpiB, was selected for further characterization. Deletion mutants of both PPIases had a reduced growth at low and high temperatures. In addition, they also exhibited a reduced sliding motility and intracellular growth in A. castellanii, THP-1 macrophage cells and HLTEs. Actually, a double mutant strain exhibited a stronger phenotype in most cases, so that compensation between the activities of both PPIases can be reasoned. In the second part, the influence of novel cycloheximid-derivatives on the growth and the Mip-dependent intracellular replication of L. pneumophila was analyzed. Some substances inhibited the growth and intracellular replication of L. pneumophila. However, this phenotype was not Mip-dependent. As a third topic, the relevance of Mip for the distribution in the environment was evaluated. It could be shown, that labelled L. pneumophila can colonize several amoebas and the intestine of an aquatic nematode species. The relevance of Mip for the colonization of the digestive tract of nematodes was further characterized in the model organism Caenorhabditis elegans, where in the absence of Mip the median of the mortality was delayed, and the colonization efficiency decreased.

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Rasch, Janine: Phänotypische Charakterisierung des Membran-assoziierten Virulenzfaktors Mip von Legionella pneumophila. 2016.

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