Neurospora crassa als Produktionswirt für heterologe Proteine: Entwicklung eines Expressionssystems und Optimierung des Produktionsprozesses

Havlik, David

Filamentöse Pilze besitzen die Eigenschaft, Proteinmengen im g/L-Maßstab zu sekretieren. Aufgrund ihrer einfachen Handhabung stellen sie daher interessante Organismen für die biotechnologische Produktion von Proteinen dar. In dieser Arbeit wurde der rote Brotschimmel Neurospora crassa als Produktionswirt für heterologe Proteine verwendet. Hierbei handelt es sich um einen etablierten Modellorganismus, weswegen viele molekulare Werkzeuge für seine gentechnische Manipulation zur Verfügung stehen und somit die Produktion auf einfache Art und Weise erreicht werden kann. Als Modellproteine wurden zwei Antikörperfragmente verwendet. Ziel dieser Arbeit war die Sekretion des Produktes in Form eines Fusionsproteins mit einem pilzeigenen Protein, hier der Glucoamylase, welches als Carrier fungiert. In der ersten Phase dieser Arbeit wurden Produktionsstämme generiert und anhand von Kultivierungen im Schüttelkolbenmaßstab bewertet. Als Carrier-Protein wurde sowohl die vollständige Glucoamylase als auch eine gekürzte Form verwendet. Es wurden verschiedene Promotoren, genetische Hintergründe und eine unterschiedliche Codon usage des Antikörperfragment-Gens miteinander verglichen. Der kritische Schritt bei der Stammerzeugung war die Beseitigung extrazellulärer Proteaseaktivität. Dazu wurden zwei Strategien verglichen: die Deletion eines Transkriptionsfaktorgens und die Deletion von mehreren Proteasegenen, welche zuvor identifiziert wurden. In der zweiten Phase wurde schrittweise ein Scale-Up auf ein Arbeitsvolumen von 9 L durchgeführt, das Wachstum charakterisiert, der Prozess optimiert und verschiedene Verfahrensweisen verglichen. Hierfür wurde zunächst ein paralleles Bioreaktorsystem (1 L) verwendet. Es wurde festgestellt, dass das verwendete Minimalmedium eine zu geringe Konzentration der Stickstoffquelle enthält. Nach der Medienoptimierung wurde gezeigt, dass der pH-Wert die verbliebene Proteaseaktivität im Kulturüberstand beeinflusst und pH 6,5 als optimaler pH-Wert für die geringste Aktivität identifiziert. Durch die Verwendung von Komplexmedium anstatt von Minimalmedium konnten sowohl die Ausbeute (15 mg/L) als auch die Wachstumsgeschwindigkeit erhöht werden. Die Ausschaltung mehrerer Proteasegene führte zu höheren Produktmengen als die Deletion des Transkriptionsfaktorgens und in beiden Medien zur vollständigen Unterdrückung der Proteaseaktivität. Das Produkt wurde abschließend mittels Affinitätschromatographie isoliert, zeigte aber nur eine geringe Aktivität auf.

Filamentous fungi have the capacity to secrete large amounts of proteins (order of g/L). Due to their simple handling they are attractive organisms for the biotechnological production of proteins. In this thesis, the red bread mold Neurospora crassa was engineered for the production of heterologous proteins. This organism has been used as a model organism for decades which is why many tools are available for its genetic manipulation. It therefore provides a suitable system for protein production. Two antibody fragments were used as model proteins. The aim of the project was to achieve secretion of the protein of interest fused to an endogenous fungal carrier protein, which in this case was the glucoamylase. In the first phase of this project, production strains were generated and the production evaluated in shaking flask scale. Both the full enzyme and a truncated version of the glucoamylase were used as carrier proteins. Different promoters, genetic backgrounds and two types of codon usage were compared. The crucial step in the generation of the production strains was the elimination of the extracellular protease activity in the culture supernatant. For this purpose, two strategies were compared: the deletion of a transcription factor gene and the deletion of several protease genes, which were identified beforehand. In the second phase, an incremental scale-up was performed up to a working volume of 9 L, the growth of the fungus was characterized, the process was optimized, and different modes of operation were compared. For the optimization, a parallel bioreactor system (1 L) was used initially. Thereby, an insufficient concentration of the nitrogen source was determined in the used minimal medium. After optimization of the medium it was shown that the remaining protease activity in the culture supernatant is influenced by the pH value of the medium, with the lowest activity at pH 6.5. By cultivating in complex medium instead of minimal medium, both the yield (15 mg/L) and the growth rate were increased. Compared to the deletion of a transcription factor gene, the deletion of multiple protease genes led to higher product yields and the complete elimination of protease activity in both media. Finally, the product was isolated via affinity chromatography although only a small amount showed activity.

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Havlik, David: Neurospora crassa als Produktionswirt für heterologe Proteine: Entwicklung eines Expressionssystems und Optimierung des Produktionsprozesses. 2015.

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