Die Serin/Threonin Kinase Prp4 aus Schizosaccharomyces pombe verbessert die Erkennung von Introns mit schwachen Spleißstellen

Eckert, Daniela

Die Genexpression in eukaryotischen Zellen gliedert sich in Transkription und verschiedene Prozessierungsschritte, wozu auch das prä-mRNA Spleißen gehört. Dabei werden aus der prä-mRNA die Introns herausgespleißt und die Exons miteinander verknüpft, so dass die reife mRNA entsteht. Das Herausspleißen der Introns wird vom Spleißosom durchgeführt, welches anhand der Exon1/5´-Spleißstelle, der Verzweigungssequenz und der 3´-Spleißstelle den Anfang und das Ende des Introns erkennt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der Serin/Threonin Kinase Prp4 untersucht, die am Spleißprozess beteiligt ist. Dazu wurde eine analog-sensitive Kinase konstruiert, die sich durch Zugabe des ATP-analogen Inhibitors 1NM-PP1 hemmen lässt. Sowohl die Analyse einzelner Introns durch RT-PCR als auch eine Sequenzierung der Gesamt-RNA zeigen nach Inhibition der Prp4 Kinase, dass zwei Klassen von Introns existieren. Die eine Klasse der Introns wird nach Inhibition der Kinase weiter effizient gespleißt, während die andere Klasse nach Inhibition prä-mRNA akkumuliert. Die Introns, die die Aktivität der Prp4 Kinase benötigen um gespleißt zu werden, werden als Prp4-abhängige Introns bezeichnet. Und die Introns, die nach Inhibition weiter effizient gespleißt werden, werden Prp4-unabhängig genannt. Der Vergleich beider Intronklassen zeigt ausschließlich in den Sequenzen der Spleißstellen geringfügige Unterschiede. Um zu untersuchen, ob die Sequenz der Spleißstellen bezüglich der Prp4-Abhängigkeit eine Rolle spielt, wurden zwei Reportergene konstruiert. Dazu wurden die Gene res1, dessen Intron Prp4 abhängig gespleißt wird, und ppk8, welches unabhängig von der Kinase gespleißt wird, ausgewählt und in den leu1-Lokus von Schizosaccharomyces pombe integriert. Die Mutationsanalyse von Exon1/5´-SS und Verzweigungssequenz zeigt, dass durch Erhöhung der Komplementarität zur U1 und U2 snRNA des Spleißosoms ein Prp4-abhängiges Intron in ein Prp4-unabhängiges Intron umgewandelt werden kann. Wird die Komplementarität der snRNAs zur prä-mRNA verringert, kann aus einem Prp4-unabhängig gespleißten Intron ein Prp4 abhängiges werden. Das zeigt, dass die Aktivität der Prp4 Kinase notwendig ist, um Introns zu spleißen, deren Spleißstellen von der Konsensussequenz abweichen und damit als schwach bezeichnet werden.

The gene expression of eukaryotic cells is divided into transcription and several processing steps. One of these processing steps is pre-mRNA splicing. In eukaryotic cells pre-mRNA consists of exons and introns and the introns have to be removed during the splicing reaction. The exons are joined together and the mature mRNA is formed. The splicing of introns is performed by the spliceosome which recognizes the beginning and the end of an intron via their exon1/5´-splice site, branch sequence and 3´ splice site. In this study the function of the serinethreonine kinase Prp4 which is involved in the splicing process is investigated. Therefore, an analog-sensitive kinase was constructed which can be inhibited using the ATP-analogue inhibitor 1NM-PP1. After Inhibition of the kinase several intron-containing genes were analyzed by RT-PCR. Moreover, the total RNA was sequenced. Both approaches revealed two classes of introns. One of these intron classes is still spliced after inhibition of the kinase while the other class accumulates pre-mRNA. The introns which need the activity of the kinase to be spliced out are called Prp4-dependent introns. And those that are spliced efficiently after inhibition of the kinase are named Prp4-independent introns. If both intron classes are compared only small differences between the sequences of the splice sites can be observed. Two reporter genes were constructed to analyse if the sequence of the splice sites play a role in Prp4-dependency. Therefore, the gene res1 which contains a Prp4-dependent intron and the gene ppk8 which contains a Prp4-independent intron were integrated into the leu1-locus of Schizosaccharomyces pombe. The analysis of different mutations in exon1/5´-SS and branch sequence showed that increasing the complementarity to the snRNAs U1 and U2 of the spliceosome can change a Prp4-dependent intron in an independent one. Decreasing the complementarity of a Prp4-independent intron leads to Prp4 dependency. That shows that the activity of the Prp4 kinase is necessary for splicing of introns whose splice sites differ from the consensus sequence. Those are called weak splice sites.

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Eckert, Daniela: Die Serin/Threonin Kinase Prp4 aus Schizosaccharomyces pombe verbessert die Erkennung von Introns mit schwachen Spleißstellen. 2015.

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