Epigenetic modulation of Doxcycline controlled transgene expression in cells and mice

Zha, Lisha

Die Tetracycline (Tet) regulierten systeme, unter Verwendung von Doxycycline induzierten Promotoren, werden häufig verwendet um eine konditionale Genexpression transduzierter Gene in Zellen verschiedener Spezies zu generieren. Obwohl diese Systeme erfolgreich in Säugerzellen angewendet werden konnten, ist die Anwendung im Mausmodell nicht so geradlinig. Interessanterweise unterscheiden sich jedoch in all diesen studien die chromosomalen Integrationsorte, das Design der Kassetten, die verwendeten Gewebe als auch die Art der Auswertung. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin das Verhalten der Tet-Kassetten in embryonalen Stamzellen sowie in Mäusen zu charakterisieren und Strategien zu entwickeln das „silencing“ dieser Doxycycline-induzierbaren Promotoren zu verhindern, um somit eine homogenere und stabilere Genexpression zu erhalten. Die erste Strategie verfolgte die Integration der Doxycycline-kontrollierten Kassetten in drei definierten chromosomalen Abschnitten (Rosa26, COL1A1 und Tigre Lokus) und die Untersuchung der Regulierbarkeit und Expression des Transgens. Konnte keiner der drei Integrationsorte die Expression der Tet-Kassette auch nach Zelldifferenzierung unterstützen. Aus diesem Grund befasste sich die zweite Strategie mit der Modifikation der „targeting“- Kassette. Hierfür wurde der Doxycyclin-induzierte Promoter von dem „chicken HS4 insulator“ umrahmt. Zudem ermöglichte die Integration des cHS4 eine teilweise erhaltene Expression des Transgens auch nach Zelldifferenzierung. Des Weiteren wurde eine dritte Strategie entwickelt, welche die Reaktivierung bereits „gesilencter“ Promotoren ermöglichen sollte. Für diesen Zweck wurde die aktive katalytische Domäne der TET1 mit dem reversen Tetrazyklin Transaktivator rtTA fusioniert. Das Protein TET1 wurde zuvor beschrieben eine Demethylierung von methylierten CpGs zu induzieren. Die Anwendung dieses Expressionvektors im Mausmodell ermöglichte eine Reaktivierung „gesilenc’ter“ Transgenexpression. Hierzu wurde die Genexpressionskassette über hydrodynamische Injektion in zwei unterschiedlichen transgenen Tierlinien eingebracht und seine Wirkung untersucht. In beiden Fällen führte die transiente Integration zu einem signifikanten Anstieg des Reportergens. Zusammenfassend zeigt sich diese neuartige Strategie als sehr vielversprechend das „silencing“ des Tet-Promotors in vitro und in vivo zu überwinden und zeigt sich ebenfalls erfolgreich in der Reaktivierung zuvor „gesilencter“ Tet-Promotoren.

The tetracycline (Tet) regulation system is being widely utilized for conditional transgenesis in cells of various species. Although the system has been successfully used in mammalian cells, the application in mice is not as straight forward. Published examples show variations in the performance of the Tet system in mice. However, these studies differ in the selected chromosomal integration sites of the Tet cassettes, the design of the cassette, the tissue investigated as well as the nature of the read-out. This hampers the direct comparison and the improvement of the system. The aim of this study was to characterize the performance of Tet cassettes located in a defined chromosomal environment in embryonic stem (ES) cells and mice and to explore strategies to overcome the silencing and heterogeneity of Tet induced transgene expression. Three chromosomal loci in the mouse genome, Rosa26, COL1A1 and Tigre loci were evaluated. Although elevated expression levels have been observed in COL1A1 and Tigre loci in ES cells compared to the expression in the Rosa26 locus, neither of them was capable of supporting expression of Tet cassettes upon differentiation, indicating that in all these sites expression is compromised related with DNA methylation. It was investigated if chromosomal shielding elements such as the chicken chromatin insulator cHS4 can prevent silencing of the Tet cassettes and stabilizes the expression. Indeed, cHS4 insulators resulted in partial rescue of expression even after differentiation. Furthermore, a novel strategy was designed to reactive the silenced Tet promoter in an active and targeted way. For this purpose, the catalytic domain from the ten eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1 (TET1) was employed. This protein has been previously shown to induce the demethylation of methylated CpGs. To specifically recruit the catalytic active domain of the TET1 to the Tet promoter a tripartite fusion protein was designed comprising the dioxygenase catalytic domain, the Tet promoter binding domain as well as the VP16 transactivating domain. The application of the expression vector in transgenic mice by hydrodynamic tail vein injection showed that the silenced Tet cassettes could even be reactivated in mice. In conclusion, this novel strategy to overcome silencing of the Tet promoter represents a promising approach to reactivate epigenetically silenced Tet promoter in vitro and in vivo.

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Zha, Lisha: Epigenetic modulation of Doxcycline controlled transgene expression in cells and mice. 2015.

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