New Strategies to Improve the Expression of Recombinant Mammalian Proteins in Engineered Animal Cell Lines

Baser, Bahar

Die Aufklärung von Proteinstrukturen liefert wertolle Einblicke in die vielfältigen Funktionen zellularer Prozesse. Jedoch müssen bestimmten Herausforderungen gemeistert werden um Proteine Struckturbiologisch analysieren zu können. Die Produktion von adequaten Mengen an kristallisierbarem Protein stellt sich vor allem für komplexe Zielproteine aus Säugetieren als mühsam dar. In solchen Fällen ist die Verwendung von Säugetierzelllinien von Vorteil. Mechanismen für die korrekte Faltung von Proteinen und die Fähigkeit posttranslationale Modifikationen durchzuführen sind in Säugetierzelllinien gegeben. Die Herstellung von stabilen Zelllinien für die rekombinante Proteinproduktion ermöglicht die robuste Expression in einer Reihe von Set-ups: vom kleinen Maßstab in Batch-Kultur bis hin zu größeren Maßstäben in Bioreaktoren. Stabile Zellliniengenerierung ist jedoch ein sehr zeitaufwendiger Prozess. Sie erfordert eine extensive Analyse und Charakterisierung von hochproduzierenden Zellklonen nach der zufälligen Integartion eines Transgenes in die Wirtszelllinie. Darüber hinaus stellen komplexe heterogene Glycanstrukturen auf der Proteinoberfläche die nächste Herausforderung dar. Diese beeinträchtigen Proteinkristallisation und Diffraktion. Mutante Zelllinien wie z.B. CHO Lec3.2.8.1 ermöglichen die Expression von Proteinen mit einer homogene GlcNAc2Man5 Glycanstruktur. Um die lösliche Expression von rekombinanten Proteinen zu fördern können verschiedene Strategien angewandt werden. Beispielsweise die Expression verkürzter oder chimerer Konstrukte alswohl die Co-expression von Multiproteinkomplexen oder molekularer Chaperone. In dieser Arbeit wurde die glykosylierungsdefizente Zelllinie CHO Lec3.2.8.1 genutzt um ein schnelles und flexibles System für die Herstellung von stabilen Zelllinien zu etablieren, welche die Co-expression von Zielproteinen in bereits charakterisierten chromosomalen Loci ermöglicht. Dieses binäre System enthält stabil integrierte Austauschkassetten welche die zielgerichtete Integration von Transgenen ermöglichen. Hiermit wird die zügige Herstellung von Produktionszelllinen mit vorhersehbaren Expressionseigenschaften gewährleistet. Dieses binäre System wurde genutzt um Produktionszelllinien für die Co expression von Toll-like Rezeptor Ectodomainen in Kombination mit Chaperonen zu generieren.

The elucidation of protein structures provides a valuable insight into the diverse functions of cellular processes. However the field of structural biology faces some major bottlenecks. The production of adequate amounts of high quality protein, particularly for complex mammalian targets can be a demanding process. In such cases the use of mammalian expression hosts is favourable to the widely used prokaryotic systems due to their capability to process the most genuine post-translational modifications and employ proper protein folding mechanisms. The generation of stable mammalian cell lines for recombinant protein production enables the robust expression in various settings from small scale batch cultures to large scale bioreactors. Stable cell line development however is a very time intensive process that requires extensive screening for high producer clones after random integration of the gene of interest into the host genome. Another challenge structural biologists are confronted with are complex heterogeneous glycosylation pattern on the protein surface. These interfere in proper crystal formation and thus diffraction analysis. The use of glycosylation mutant cell lines such as CHO Lec3.2.8.1, that express a uniform glycosylation profile of the high mannose type (GlcNAc2Man5), address this problem. To improve the soluble expression of recombinant proteins various strategies can be pursuit. This includes the expression of truncated and chimeric constructs as well as the co-expression of multi protein complexes and molecular chaperones. In this work the glycosylation deficient cell line CHO Lec3.2.8.1 was used to create a fast method to generate stable producer cell lines that co-express target genes at pre characterized chromosomal loci. Binary CHO Lec3.2.8.1 master cell lines, stably tagged with two different exchange cassettes comprising fluorescent marker genes, were established during this work. Targeted integration of recombinant genes into these pre defined genomic loci using recombinase mediated cassette exchange (RMCE), based on the Flp/FRT system, enables the fast generation of stable producer cell lines with predictable expression properties. This binary system was used to generate producer cell lines for the expression of Toll-like receptor ectodomains in combination with molecular chaperones.

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Baser, Bahar: New Strategies to Improve the Expression of Recombinant Mammalian Proteins in Engineered Animal Cell Lines. 2015.

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