Amplification of Brain Aggregated-Amyloid Beta by developing an Amyloid Beta Conformational Seeding Assay

Krishnan, Shyamkumar

Die Amyloidhypothese besagt, dass die Aggregation und Akkumulation von Amyloid Beta (Aβ)-Peptiden (Aβ40 & Aβ42) im Gehirn die Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) wesentlich vorantreibt, da Aβ-Aggregate ihre Konformationseigenschaften auf normal gefaltete Einheiten übertragen können. Es gibt eine steigende Zahl an Hinweisen, dass Aβ auch als „Seed“ fungieren kann. Kürzlich wurde über einen Zusammenhang zwischen verschiedenen Aβ42-Konformationen im Gehirn und einem schnellen Krankheitsfortschritt berichtet. So kann die strukturelle Konformation von Aβ42 als neue Variable in der AD-Pathogenese definiert werden (Cohen et al., 2015). Thio-T-fluoreszenzbasierte in vitro „Seeding“-Assays ermöglicht die Amplifikation von Aβ-Konformationen aus Gehirnen, wobei diese Tests auf die Verwendung von löslichem Aβ40 als Substrat beschränkt sind. Außerdem ist bekannt, dass Aβ42-Fibrillen kein Aβ40-Substrat „seeden“ können. Daher ist die 3D-Konformation von Aβ42 im Gehirn schwer erfassbar und bleibt eine große Herausforderung in der AD-Forschung dar. Unsere Forschung stellt sich dieser Herausforderung durch die Entwicklung eines in vitro-basierten Aβ Konformations-„Seeding“-Assays (Aβ-CSA), der rekombinantes Aβ(1-42)M35L Peptid als Substrat verwendet. Hirnhomogenate von sechs Monate alten transgenen Mäusen [APP/PS1 (TG/WT)] und BL6-Mäusen wurden als Aβ-„Seeds“ mit Hirnursprung im Assay verwendet. Die TG-Mäuse enthielten Hirn-aggregierte Aβ-„Seeds“; WT und BL6 wurden als Negativkontrollen verwendet. Die von Hirn-aggregiertem Aβ „geseedete“ Fibrillenwachstumskinetik äußerte sich im Test durch eine deutlich höhere Fluoreszenz und kürzere Lagzeit. Die Amplifikation wurde anschließend durch zwei Methoden bestätigt: (i) TEM-Analyse und (ii) einer neuen biophysikalischen Methode zur Fragmentierung von Fibrillen, der akustischen SSA (Selective Shear Amplification), die in unserem Labor zur Amplifikation von Prionen entwickelt worden ist. Die Ergebnisse deuten auf Unterschiede in der mechanischen Fragmentierbarkeit von mit APP/PS1(TG) „geseedeten“ und mit APP/PS1 (WT) oder BL6 „geseedeten“ Fibrillen hin, was auf Konformationsunterschiede zurückzuführen sein könnte. Der hier entwickelte Aβ-CSA mit Aβ(1-42)M35L als Substrat ist der erste Assay, der Gehirn-aggregiertes Aβ amplifiziert und deutliche Unterschiede in „Seed“-Kinetik, TEM und akustischer SSA zeigt. Diese Aβ-CSA-Plattform ist ein initialer Schritt zur Amplifikation von Hirn-aggregiertem Aβ, das an der Alzheimer-Krankheit beteiligt ist.

The Amyloid Hypothesis deliberates that Amyloid Beta (Aβ) peptides (Aβ40 & Aβ42) aggregation and accumulation in the brain progresses Alzheimer Disease (AD) pathogenesis because Aβ aggregates can transfer their conformational properties to normally folded units. Recently, a study reported a link between distinct brain-Aβ42 conformations and rapid clinical decline, defining Aβ42 structural conformation as a new variable in AD pathogenesis (Cohen et al. 2015). The development of thio-T fluorescence based in-vitro seeding assays have enabled amplification of Aβ conformations from brains, however these assays have been largely limited to utilizing Aβ40 as substrate. Additionally, it is known in seeding studies that Aβ42 fibrils cannot seed the Aβ40 substrate. Due to this, the Aβ42 AD specific 3D conformation in brain remains a major bottleneck in AD research. Our research confronts this challenge by developing an in-vitro based Aβ Conformational Seeding Assay (Aβ-CSA) that utilizes recombinant Aβ(1-42)M35L peptide as the substrate. Brain homogenates (BH) from 6-month transgenic mice [APP/PS1(TG/WT)] & BL6 mice were used as seed material in the assay. The TG mice contain brain-aggregated-Aβ (BA-Aβ) seeds; WT & BL6 are used as negative controls. The BA-Aβ seeded fibril growth kinetics was distinctly detected in the assay with a higher fluorescence and a shorter lagtime. The BA-Aβ seed amplification was later confirmed by two methods: (i) TEM & (ii) A novel biophysical fibril fragmentation method Acoustic-SSA (Selective Shear Amplification) developed in our lab for prion amplification. The results indicate a difference in the specific mechanical fragmentability between the APP/PS1(TG) seeded and APP/PS1(WT) or BL6 BH seeded fibrils arising out of inherent conformational differences. The developed Aβ-CSA with Aβ(1-42)M35L as substrate is the first assay to amplify BA-Aβ and show distinct differences by seeding kinetics, TEM & Acoustic-SSA. The developed Aβ-CSA platform is an early step towards amplifying the BA-Aβ conformations involved in AD.

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Krishnan, Shyamkumar: Amplification of Brain Aggregated-Amyloid Beta by developing an Amyloid Beta Conformational Seeding Assay. 2015.

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