Funktionelle Analyse starker MAMP-responsiver synthetischer Promotoren

Lehmeyer, Mona

Microbe-associated molecular pattern (MAMP) sind zum Beispiel Moleküle von Pathogenen, die bei Pflanzen eine durch cis-regulatorische Sequenzen vermittelte Hochregulation von Abwehrgenen bewirken. Grundlage der vorliegenden Arbeit war die vorangegangene Identifizierung neuer MAMP-responsiver cis-Sequenzen aus Arabidopsis thaliana. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die funktionelle Analyse der zwei stärksten MAMP-responsiven cis-Elemente. Dabei handelt es sich zum einen um das cis-regulatorische Modul (CRM) des DJ1E-Gens und zum anderen um die MAMP-responsive Sequenz (MRS) des At1g13990-Gens. Das CRM-DJ1E ist essentiell für die MAMP-responsive Genexpression des Gens DJ1E. Es enthält drei funktionelle MAMP-responsive cis-Sequenzen, zwei WT-Boxen GGACTTTT und GGACTTTG sowie eine GCC-ähnliche Box GCCACC. Das CRM-DJ1E ist Salizylsäure (SA)-responsiv, wobei die GGACTTTT-Box essentiell ist. Die GGACTTTG und GCCACC-Box sind notwendig für die volle SA-Induktion. Die in dieser Arbeit identifizierten AP2/ERF-Transkriptionsfaktoren (TF) ORA59 und ERF10 interagieren antagonistisch mit der GCC-ähnlichen Box des CRM-DJ1E, wobei es sich bei ORA59 um einen Aktivator und bei ERF10 um einen Repressor handelt. Die Kernsequenz GCCNCC ist für die Interaktion mit ORA59 essentiell. TF die mit den WT-Boxen interagieren konnten nicht identifiziert werden. Die MRS-At1g13990 liegt in einer außergewöhnlich kurzen intergenischen Region. Sie ist für eine MAMP-vermittelte Genexpression von At1g13990 ausreichend, wobei die 3´UTR des upstream liegenden Gens noch zusätzlich einen quantitativen Effekt aufweist. Die MRS-At1g13990 enthält eine 10 bp lange, für die MAMP-Responsivität essentielle Kernsequenz TCGTTTACGT. Für eine voll ausgeprägte MAMP-vermittelte Genexpression ist jedoch die gesamte MRS nötig. In transgenen A. thaliana-Pflanzen vermittelt das CRM-DJ1E sowie die MRS-At1g13990 Pathogen-induzierte Reportergenaktivität gegenüber einem virulenten und avirulenten Pseudomonas syringae Stamm und dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea. Die beiden Pseudomonas Stämme zählen zu den biotrophen bzw. hemi-biotrophen Pathogenen. Die erhöhte Basalaktivität der MRS-At1g13990 demonstriert die niedrige Spezifität des synthetischen Promotors. Im Vergleich dazu ist die Pathogen-induzierte Reportergenexpression der transgenen CRM-DJ1E-Pflanzen präzise um die Infektionsstelle lokalisiert. Es ist kaum eine Hintergrundexpression zu erkennen. Somit ist dieses Element vermutlich geeignet für die Entwicklung Pathogen-resistenter Pflanzen, bei denen es zu einer Induktion von Zelltod-vermittelnder Gene kommt. Für das bessere Verständnis der Wirkungsweise dieses Elementes ist eine Identifikation der übrigen WT-Box-bindenden TF von Vorteil.

Microbe-associated molecular pattern (MAMP) are for example molecules from pathogens that upregulate defense genes through specific cis-regulatory sequences. The basis of this work was the previous identification of novel MAMP-responsive cis-sequences from Arabidopsis thaliana. The aim of this work is the functional dissection of the two strongest MAMP-responsive cis-elements, the cis-regulatory module (CRM) of the DJ1E gene and the MAMP-responsive sequence (MRS) of the At1g13990 gene. The CRM-DJ1E is essential for the MAMP-responsive gene expression of the DJ1E gene. It has three functional MAMP-responsive cis-sequences, two WT-boxes GGACTTTT and GGACTTTG and a GCC-like box GCCACC. The CRM-DJ1E is salicylic acid (SA)-responsive, whereby the GGACTTTT-box is essential and the GGACTTTG and GCCACC-box are necessary for the full SA-induction. In this work, the transcription factors (TF) ORA59 and ERF10 were identified to interact antagonistically with the CRM-DJ1E. ORA59 is an activator and ERF10 a repressor of the CRM-DJ1E. The core sequence GCCNCC is essential for the interaction with ORA59. TF interacting with the WT-boxes were not identified. The MRS-At1g13990 is located in an extraordinarily short intergenic region. It is sufficient for the MAMP-responsive gene expression of At1g13990. Furthermore the 3´UTR-Region of the upstream gene has a quantitative effect on the MAMP-induced gene expression. The MRS-At1g13990 contains an essential core-sequence TCGTTTACGT, which is 10 bp long. For a full MAMP-responsive gene expression the whole MRS is necessary. Transgenic A. thaliana plants harbouring the CRM-DJ1E and MRS-At1g13390 show pathogen-induced reporter gene activity in response to virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and to the necrotrophic fungus Botrytis cinerea. Both Pseudomonas strains are hemi-biotrophic. The high background activity of the MRS-At1g13990 under non-infected conditions demonstrates a low specificity of the synthetic promoter. In contrast, the CRM-DJ1E shows pathogen-induced reporter gene expression precisely located around the infected area. Therefore, it may be suitable for the development of pathogen resistant plants by inducing cell death mediating genes. To better understand the function of this element an identification of the WT box-binding transcription factors is of advantage.

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Lehmeyer, Mona: Funktionelle Analyse starker MAMP-responsiver synthetischer Promotoren. 2015.

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