Towards Structural Understanding of Phospholipase PlaB from Legionella pneumophila

Pham, Van

Legionella pneumophila (L. pneumophila) ist die Hauptursache für Legionellose, deren ernste Form, die Legionärskrankheit, tödlich verlaufen kann. In letzter Zeit wurde in Deutschland ein starker Anstieg der Legionellose als Ursache für ambulant erworbene Pneumonie sowohl in stationär als auch in ambulant behandelten Krankenhauspatienten beobachtet. Die Bakterien besitzen eine Vielzahl von Phospholipasen, welche Phospholipide spalten und dadurch verschiedenen Produkte freisetzen, die die bakterielle Invasion und Virulenz unterstützen. Zu ihnen gehört PlaB, die vorherrschende zell-assoziierte Phospholipase deren Aktivität zu Lungenentzündung und markantem Velust von funktionaler epithelialer Zellschicht und somit Zersörung von Lungengewebe führt. Der detailierte Mechanismus der PlaB-Aktivität ist noch unbekannt. Es ist darüber hinaus ein neuartiges Protein für welches noch keine homologe Struktur zur Verfügung steht. Strukturelle Information über PlaB könnte deshalb die Grundlage bilden für die Aufklärung des enzymatischen Mechanismus im Allgemeinen und der PlaB-Familie im Besonderen. Die Sruktur des Komplexes aus dem Protein und seinen Substraten würde auch die Möglichkeit zur Entdeckung neuer Medikamente bieten, welche antibakterielle Resistenzen umgehen könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden Wege zur großmaßstäblichen Expression und Reinigung von PlaB und seinen SeMet-markierten Derivaten etabliert, und das Protein wurde bis zur Homogenität gereinigt. Kristalle wurden gezüchtet, und ein nativer Datensatz mit einer Auflösung von 2.6 Å wurde gesammelt. Alle Kristalle waren jedoch entweder verzwillingt, wie im Falle der hexagonalen Kristallform, oder oder sehr stark anisotrop, wie im Falle der triklinen Kristallform. Das machte es unmöglich, das Phasenproblem zu lösen und die Struktur zu bestimmen. Externe Parameter und chemische Modifikationen des Proteins wurden untersucht, um diese Probleme zu lösen. Kristalle mit anderer Morphologie konnten von einer C-terminal verkürzten Version des Proteins gezüchtet werden, was Anlass zur Hoffnung gibt, dass diesen nicht die gleichen Probleme anhaften, die zum Haupthindernis dieser Arbeit wurden.

Legionella pneumophila (L. pneumophila) is the major cause of Legionellosis, of which the severe form, Legionnaires’ disease, can lead to death. Recently, it is increasingly observed as a leading cause of community-acquired pneumonia (CAP) in hospitalized and ambulatory patients in Germany. The bacteria possess a variety of phospholipases that cleave phospholipids, releasing various products which facilitate the invasion and virulence of bacteria. Among them, PlaB is the major cell-associated phospholipase, the activity of which leads to lung inflammation and prominent loss of functional epithelial cell layer in the lung and hence to the destruction of lung tissue. The detailed mechanism of the PlaB activity remains unknown. It is also a novel protein for which no structural homolog is available. Structural information of PlaB may thus establish a foundation to elucidate enzymatic mechanism of the enzyme in particular and PlaB family in general. Structure of a complex between the protein and its substrates will also offer lead for the discovery of novel drug to counteract antibacterial resistance. In this work, schemes for large-scale expression and purification of PlaB and SeMet-labeled derivatives were established, and the protein was purified to homogeneity. Crystals were grown and a native data set of the protein crystal was obtained at the resolution of 2.6 Å. However, the crystals were either twinned when it was in hexagonal form or seriously anisotropic in triclinic form. This made it impossible to obtain phase information for structural determination. External parameters as well as chemical modifications of the protein itself were investigated intensively to solve these issues. A different crystal morphology of a C-terminal truncated version of the protein was obtained, giving hope that it would not have these two issues that have been the bottleneck of this work.

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Pham, Van: Towards Structural Understanding of Phospholipase PlaB from Legionella pneumophila. 2015.

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