Conformation based in vitro selection of mammalian prion seeds – Propagation and characterization of prion strains

Felix Helge Deluweit

Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Prionenerkrankungen stellen eine signifikante Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen klare Zusammenhänge zwischen dieser Art von Erkrankungen und einem spezifischen Proteinfaltungs- und Aggregationsprozess, dem Corruptive-Protein-Templating oder Seeding. Die Interaktion von Proteinmonomeren mit ihren fehlgefalteten Konfomeren, auch Seeds genannt, führt dabei zu einer konformationellen Änderung, ähnlich einem angeimpften Kristallisationsprozess. Dieser sich höchstwahrscheinlich selbsterhaltende Mechanismus führt bei fortschreitender Aggregation der harmlosen Monomere somit auch zu einer Amplifikation der Seeds. Das gängigste Beispiel für diese Art von Proteinfehlfaltung findet bei den Prionenerkrankungen der Säugetiere, wie der Traberkrankheit bei Schafen oder BSE bei Rindern sowie der neuen Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit beim Menschen. Unter Verwendung periodischer Ultschrallimpulse konnte die Prioninfektivität in vitro uneingeschränkt erhalten werden – eine Technik, die unter dem Namen Protein-Misfolding-Cyclic-Amplifikation (PMCA) bekannt ist. Es ist davon auszugehen, dass die Amplifikation von Prionen in vitro dabei durch eine periodische Fragmentierung der Seeds vorangetrieben wird. Wir konnten zeigen das die PMCA erfolgreich dazu benutzt werden kann Hamsterprionen des Stamms Sc237 zu amplifizieren, haben aber auch die Limitierungen der Methode hinsichtlich ihrer Reproduzierbarkeit aufzeigen können. Basierend auf einer konformationssensitiven Fragmentierung der Seeds konnte das Konzept der Selective-Shearing-Amplification (SSA) entwickelt werden. Die Fragmentierung der Seeds wird dabei durch fein justierbare Scherkräfte in vitro ermöglicht. Der Hypothese folgend, dass konformationelle Seed-Polymorphismen unterschiedliche strukturelle Stabilitäten implizieren, sollte es möglich sein uniforme Seed-Populationen aus natürlichen und potentiell heterogenen Seed-Populationen zu selektieren. Der Einsatz der SSA führt daher zu einem selektiven Vorteil für optimal fragmentierte Seeds, die wiederum eine dominante Spezies ausbilden. Im Gegensatz dazu werden Seed-Population mit einer abweichenden mechanischen Fragmentierbarkeit supprimiert. Zur Validierung des Konzepts der SSA wurden die Amplifikation der sehr änlichen Hamsterprionenstämme Sc237 und 263K mit Hilfe einer neuen Ultraschall- als auch unter Verwendung eines mechanischen Ansatzes untersucht.

Neurodegnerative disordes like Alzheimers disease, Parkinsons disease and infec-tious prion diseases pose a significant threat to human health. Recent research associates these diseases with corruptive protein templating or seeding. Interaction of protein monomers with their misfolded confomers, or seeds, induces a confor-mational alteration which resembles seeded crystallization. The presumably self-perpetuating mechanism leads to seed amplification as the pathogenic aggregates corrupt more and more benign monomers over time. The first example of a self-templated protein misfolding was given by mammalian prion diseases, such as scrapie in sheep, BSE (bovine spongifrom encephalopathy) in cattle or new variant CJD (Creutzfeldt-Jakob disease) and kuru in humans. It was demonstrated that prion infectivity can be maintained infinetely in vitro if periodic ultrasound pulses are used, a technique called Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA). In this context, it was proposed that prion amplifcation in vitro is promoted due to periodical fragmentation of the seeds. We successfully used PMCA to amplify Sc237 hamster prions, but also revealed the limitation of the method regarding its reproducibility. Based on conformation sensitive seed fragmentation we therefore developed the concept of Selective Shearing Amplification (SSA), which achieves seed fragmentation by fine-tuned shear forces in vitro. We hypothesized that conformational seed polymorphisms imply different structural stabilities. Thus, uniform seed populations might be conformationally selectable from natural, potentially mixed seed populations. Starting from a mixture SSA confers a selective advantage for optimally fragmented seeds which then become the dominant species. As opposed to this, seed populations which show a distinct mechanic fragmentability are suppressed. To validate the concept of SSA we surveyed the amplification of the closely related hamster prion strains Sc237 and 263K using a new ultrasonic as well as a mechanical approach.

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Felix Helge Deluweit: Conformation based in vitro selection of mammalian prion seeds – Propagation and characterization of prion strains. 2015.

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