Produktion, Charakterisierung und Immobilisierung von nativ und rekombinant hergestellten Fructosyltransferasen zur Synthese neuartiger Fructooligosaccharide

Götze, Sven

Der Einsatz dieser kurzkettigen Glycoside erstreckt sich breitgefächert von medizinischen Therapeutika und Pharmaprodukten bis hin zu Kosmetik- und Lebensmittelprodukten. Im Fokus dieser Arbeit stand die Synthese von Fructooligosacchariden (FOS) durch eine Fructosyltransferase (FTF) aus Bacillus subtilis NCIMB 11871 und eine ß-Fructofuranosidase (ßFF) aus Aspergillus niger AB1.13. Die Aufarbeitung der nativ sekretierten FTF wurde durch geringe FTF-Konzentrationen in großen Kulturvolumina und die Anreicherung von Levan erschwert. Eine 50 kDa große FTF konnte isoliert werden. Die Gensequenz wurde als sacB identifiziert und in E. coli kloniert. Das Zellextrakt beinhaltete bis zu 370 U/ml der rekombinanten FTF. Hohe Konzentrationen an inclusion bodies konnten isoliert und als einheitliche und hochreine FTF-Charge renaturiert werden. Das während der Dialyse ausgefallene Protein konnte gut gelagert und auch mehrfach zur Renaturierung eingesetzt werden. Die spezifische Aktivität wurde gegenüber den Zelllysatüberständen mit bis zu 264,9 U/mg um das 100-fache gesteigert. Für die nativ sowie die rekombinant produzierten FTFs wurden die kinetischen Parameter ermittelt. In Gegenwart guter Akzeptoren, wie Xylose oder Galactose, wurde die Polymer-bildung und die Hydrolyse zugunsten einer höheren Transfructosylierungsaktivität reprimiert. Die Immobilisierung mittels Adsorption an Bentonit, Na-Bentonit und Hydroxylapatit sowie der Geleinschluss in Alginat hatten einen stark aktivierenden Einfluss auf die Transferge-schwindigkeit, so dass der Transfructosylierungsanteil von 35 % für die freie recFTF auf 50 % mit Bentonit und 72 % mit Hydroxylapatit bzw. Alginat anstieg. Die Annahme, dass die Ionen der Trägerstruktur eine aktivierende Wirkung auf die Transferaseaktivität haben, wurde durch Versuche mit den freien Ionen Ca2+, Mg2+, Al3+, Fe2+ und Fe3+ bestätigt. Eine trägervermittelte Rückfaltung mit Hydroxylapatit zeigte deutlich höhere Ausbeuten an aktivem Enzym als ohne die Zugabe des Adsorbens. Die rekombinant produzierte ß-Fructofuranosidase Suc1 wurde enzymkinetisch charakterisiert und zur Bildung neuartiger FOS verwendet. Beim Einsatz der Saccharosederivate Mannosyl-, Galactosyl- und Xylosylfructosid entstanden Inulintyp-FOS mit unterschiedlichen Pyranosylköpfen. Diese zielgerichtete Synthese macht hohe Ausbeuten von neuartigen 1 Kestose- und 1-Nystosederivaten möglich. Das Einsatz-spektrum wird jedoch durch die hohe Substrat- und Akzeptorspezifität einschränkt.

The use of these short chain glycosides ranges considerably from medical drugs and pharmaceutical products to cosmetics and food products. This research was focused on the synthesis of fructooligosaccharides (FOS) by a fructosyltransferase (FTF) from Bacillus subtilis NCIMB 11871 and a ß-fructofuranosidase (ßFF) from Aspergillus niger AB1.13. The recovery of the secreted native FTF was hindered by low enzyme concentrations in large volumes of supernatant and the accumulation of viscous levan. The isolated fructosyltransferase was determined with a molecular weight of 50 kDa. The gene sequence was identified as sacB and cloned into E. coli. The cell extract contained up to 370 U/ml of recombinant FTF. High concentrations of inclusion bodies were isolated and refolded as a uniform and highly purified FTF. During dialysis precipitated protein can be stored and recycled for the refolding. The specific activity increased up to 264.9 U/mg by a factor of 100 compared to the cell extract supernatant. The kinetic parameters were determined for the native and the recombinant produced FTFs. The deceleration of polymer formation and hydrolysis by addition of good acceptors such as xylose or galactose, causes an increasing transfructosylation activity.The immobilization by adsorption on bentonite, Na-bentonite and hydroxyapatite as well as the gel inclusion in alginate increase the transfructosylation velocity. Hence the transfructosylation ratio of 35 % for the free recFTF raised up to 50 % with bentonite and to 72 % with hydroxyapatite/alginate. Experiments with the free ions of Ca2+, Mg2+, Al3+, Fe2+ and Fe3+ confirmed an activating effect on the transferase velocity of immobilized FTF. A carrier-mediated refolding with hydroxyapatite showed higher yields of active enzyme than without the adsorbens addition. The recombinant ß-fructofuranosidase Suc1 was characterized and has been used to synthesize novel FOS. By using the sucrose derivatives mannosyl-, galactosyl- and xylosylfructoside inulin-type FOS with various pyranosyl-heads were obtained. A tailor-made synthesis of novel 1-kestose and 1 nystose derivates enables very high yields, but the high specificity of substrates and of acceptors limits the range of products.

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Götze, Sven: Produktion, Charakterisierung und Immobilisierung von nativ und rekombinant hergestellten Fructosyltransferasen zur Synthese neuartiger Fructooligosaccharide. 2015.

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