New Perspectives on Post-Transcriptional Regulation Mechanisms in Pseudomonas aeruginosa

Brouwer, Stephan

Regulation der Genexpression spielt eine zentrale Rolle in der bakteriellen Anpassungsfähigkeit an sich verändernde Umweltbedingungen. Quorum sensing (QS) Systeme sind ein wesentlicher Bestandteil dieses regulatorischen Netzwerkes und koordinieren bakterielle Reaktionen bei hoher Zelldichte. In dem nosokomialen Pathogen Pseudomonas aeruginosa existiert ein komplexes QS Netzwerk, welches die Synthese von Virulenzfaktoren kontrolliert die wichtig für die Pathogenese sind. Allgemeines Ziel dieser Dissertation war es, Einblicke in neuartige Regulationsmechanismen auf QS-basierender Genexpression auf dem post-transkriptionellen Level zu gewinnen. In diesem Zusammenhang haben wir die S-Adenosyl-L-Methionin-abhängige Methyltransferase (PrmC) charakterisiert, die spezifisch ein konserviertes GGQ Motif der Terminationsfaktoren methyliert. Es wurde gezeigt, dass prmC Mutation vorwiegend die Expression wichtiger Virulenz-assoziierter Faktoren betraf und eine Abschwächung der Virulenz in einem Galleria mellonella Larven Infektionsmodel zur Folge hatte. Zudem wurde ein zuvor unerkannter post-transkriptioneller Regulationsmechanismus charakterisiert. Dieser umfasst eine RhlR-vermittelte transkriptionelle Induktion einer Sekundärstruktur in der 5‘ nicht-codierenden Region des pqs Operon Transkripts. Die daraus resultierende Haarnadel-ähnliche Struktur verhindert sterisch den Zugang des Ribosoms an die ribosomale Bindungsstelle und unterdrückt auf diese Weise das pqs Signalsystem. Ein weiterer wichtiger Fokus dieser Arbeit bestand darin, ribosome profiling (Ribo-Seq) zu etablieren. Die Ribo-Seq Technik basiert auf dem deep sequencing von Ribosom geschützten mRNA Fragmenten, und verschafft eine globale Momentaufnahme der Translation in vivo. Dieses leistungsfähige methodische Werkzeug eröffnet umfangreiche Perspektiven im Hinblick auf das sich entwickelnde Bild der post-transkriptionellen Regulation in P. aeruginosa. Schließlich liegt ein Fokus dieser Dissertation auf der Rolle von PqsE als wichtiger Bestandteil des pqs QS Systems in der Regulation QS-abhängiger Virulenzfaktorproduktion. Wir konnten zeigen, dass PqsE ein Enzym ist, welches in den Kohlenstoffstrom an dem Chorisminsäure Verzweigungspunkt des komplexen metabolischen Netzwerkes von P. aeruginosa eingreift. Durch den Einsatz eines multi-methodischen Ansatzes schlagen wir vor, dass PqsE in der Phenylpyruvat Biosynthese involviert ist, welches ein mögliches Signalmolekül für das rhl QS System darstellt.

Regulation of gene expression plays a key role in bacterial adaptability to changes in the environment. Quorum sensing (QS) systems constitute an integral part of this gene regulatory network and coordinate bacterial responses under high cellular densities. In the nosocomial pathogen Pseudomonas aeruginosa, a sophisticated QS network exists controlling virulence factor synthesis important for pathogenesis. The overall aim of this thesis was to gain insight into novel regulation mechanisms of QS-based gene expression at the post-transcriptional level. In this context, we characterized the S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase (PrmC), specifically methylating a conserved GGQ motif of peptide chain release factors. Mutation of prmC was shown to predominantly affect the expression of major virulence-associated factors and caused attenuation of virulence in a Galleria mellonella larvae infection model. Furthermore, a previously unrecognized post-transcriptional regulation mechanism in bacteria was characterized. This involved an RhlR-mediated transcriptional induction of a secondary structure in the 5' untranslated region of the pqs operon transcript. The resulting hairpin-like structure sterically hinders ribosomal access to the ribosome binding site thus repressing pqs signaling. Another important focus of the work was to establish ribosome profiling (Ribo-Seq). The technique Ribo-Seq is based on deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments and provides a global snapshot of translation in vivo. This powerful tool opens up wide-ranging prospects to the developing picture of post-transcriptional regulation in P. aeruginosa. Finally, the present thesis focuses on the role of PqsE as part of the pqs QS system in regulating QS-dependent virulence factor production. We provide evidence that PqsE is an enzyme that interferes with carbon flow at the chorismate branching point in the complex metabolic network of P. aeruginosa. By using a multi-methodological approach, we suggest that PqsE is involved in the biosynthesis of phenylpyruvate, being a possible signal molecule for the rhl QS system.

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Brouwer, Stephan: New Perspectives on Post-Transcriptional Regulation Mechanisms in Pseudomonas aeruginosa. 2015.

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