Natürliche Kompetenz und Proteinexport in Bacillus megaterium – Grundlagen und biotechnologische Anwendungen

Knuuti, Kai Tobias

Das Bakterium Bacillus megaterium wurde während der letzten 15 Jahre für die Produktion und Export rekombinanter Proteine im g/L Maßstab entwickelt. Dabei sind das Einbringen von DNA und der Proteinexport mittels SEC-Exportsystems limitierend. B. megaterium besitzt die Gene für ein natürliches Kompetenz-, also DNA-Aufnahmesystem, zeigt aber keine natürliche Kompetenz. So wurden zuerst 9 B. megaterium Wildtyp-Stämme auf natürliche Kompetenz untersucht, allerdings ohne Erfolg. Offensichtlich erfolgt die Regulation der Kompetenzgene deutlich anders als im gut transformierbaren Modellorganismus Bacillus subtilis. Um die Promotoraktivitäten der Kompetenzgene von B. megaterium zu analysieren, wurde zuerst das bakterielle Luziferase System als Reportersystem als sensitive Alternative zu Gfp etabliert. Damit konnte gezeigt werden, dass die Expression der Kompetenz-assoziierten Gene comGABCDEFG, comFA, comK und ssbB Wachstumsphasen- und Substrat-abhängig ist und durch die extrazelluläre Protease NprM negativ beeinflusst wird. Anschließende Transkriptomanalysen zeigten, dass NprM die Expression von 76 Genen reguliert. So wurde das Gen des globalen Übergangszustands-Regulator AbrB in einer nprM-Deletionsmutante ~13-fach geringer transkribiert. Diese Mutante war über etablierte Methoden besser transformierbar als der Wildtyp. Durch in silico Analysen konnte ComKBmeg, das eine Homologie zu dem zentralen Regulator der natürlichen Kompetenz in B. subtilis aufweist, der Gruppe der ComK2 Proteine zugeordnet werden, deren Funktion sich von ComKBsub unterscheidet. In dieser Arbeit gelang die rekombinante Produktion und Reinigung von ComKBmeg, was in Zukunft eine proteinbiochemische Untersuchung und Aufklärung der Funktion erlaubt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden im Genom von B. megaterium 308 Signalpeptide des SEC-Pathways bioinformatisch identifiziert. Um Funktionalität und Effektivität für die Sekretion rekombinanter Protein zu untersuchen, wurde ein Plasmid-basiertes Screening-System entwickelt, das den Einbau eines Signalpeptids und des Gens eines zu sekretierenden Proteins erlaubt. Der „proof of principle“ mit 41 Signalpeptiden und der a-Amylase AmyE als Reporterprotein zeigte, dass alle vorhergesagten Aminosäuresequenzen auch Signalpeptide waren und sich in ihrer Effizienz der Vermittlung des Proteinexports bis zu einem Faktor von 23 unterschieden. Es konnte kein Zusammenhang zwischen Aminosäuresequenz des Signalpeptids und Sekretionseffizienz abgeleitet werden.

During the last 15 years, the bacterium Bacillus megaterium has been optimized for the gram per liter scale production and secretion of recombinant proteins. For the overall process, the genetic transformation efficiency and the export of proteins via the SEC-pathway were identified as limiting factors. B. megaterium contains all genes necessary for natural competence, the uptake of DNA from the environment, but it has not been observed yet. Therefore, 9 wild-type strains of B. megaterium were screened for natural competence, without success. These results indicated, that the regulation of competence-associated genes differs between B. megaterium and the efficiently transformable model organism Bacillus subtilis. To study the promoter-activity of the competence-associated genes, the bacterial luciferase system was established as a alternative for the Gfp. Using this system, the expression of the competence-associated genes comGABCDEFG, comFA, comK and ssbB was shown to be growth-phase and substrate-dependent and influenced by the extracellular protease NprM. Transcriptome analyses showed 76 genes to be differently expressed in dependence of the protease. One of them coded for the global transition-state regulator AbrB, whose expression was found to be ~13-fold down regulated in a nprM deficient strain. This strain also showed a higher transformation rate than the wild-type strain. In silico analyses identified the protein ComKBmeg, which revealed significant amino acid sequence homology to the master regulator of competence in B. subtilis. However, it was characterized as a member of the family of ComK2 proteins, which have been shown to exhibit other functions than ComKBsub. The recombinant production and purification of ComKBmeg was achieved, allowing for its further biochemical characterization. In the second part of this work, 308 signal peptides of the SEC secretion pathway were bioinformatically identified in B. megaterium. A plasmid-based screening system was constructed, allowing for the analyses of signal peptide function and secretion efficiency in context with any protein. As a “proof of principle”, 41 signal peptides were selected. Using the a-amylase AmyE as a reporter protein, tested signal peptides were shown to be functional with the amount of secreted AmyE differing up to ~23-fold in dependence of the signal peptide. No correlation between protein secretion efficiency and the amino acid sequence of the signal peptides was observed.

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Knuuti, Kai Tobias: Natürliche Kompetenz und Proteinexport in Bacillus megaterium – Grundlagen und biotechnologische Anwendungen. 2015.

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