Structural investigation of the Yersinia pseudotuberculosis AB-toxin CNFy

Heidler, Thomas Volker

Das erstmals 2007 entdeckte CNFy gehört aufgrund seines Aufbaus zu den AB-Toxinen und ist essentiell für Yersinia-Infektionen. Aufgrund seiner Deamidaseaktivität, mit welcher es kleine Rho-GTPasen dauerhaft aktiviert, wurde es zusammen mit CNF1 bis CNF3 von E. coli und DNT aus Bordetella in der Proteinfamilie der zytotoxischen nekrotisierenden Faktoren (CNF) zusammengefasst. Das Modelprotein dieser Familie, CNF1, wurde bereits teilweise kristallisiert. In vivo und in vitro Daten bezüglich der Aktivität und Spezifität sind bekannt. Um das existierende Wissen über die Aufnahme in die Wirtszelle und die Aktivität der CNF-Proteine zu erweitern, war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit die strukturelle und biochemische Charakterisierung von CNFy. Aus dem zur Verfügung gestellten Volllängeplasmid (Prof. Dr. Petra Dersch, HZI Braunschweig) wurden weitere CNFy-Konstrukte generiert. Diese wurden nach einer durchgeführten rekombinanten Expression auf ihre Löslichkeit getestet. Reinigungsprotokolle von ausgewählten stabilen Varianten wurden optimiert und gewonnene Proteinmengen bei der Suche nach erfolgversprechenden Kristallisationsbedingungen eingesetzt. Infolgedessen wurden Bedingungen mit wachsenden Kristallen wiederum optimiert und die resultierenden Kristalle zur Datengewinnung röntgenografisch vermessen. Auf diesem Wege konnten Datensätze für das Volllängeprotein sowie für die katalytische Domäne von CNFy aufgenommen werden. Die Röntgenstruktur der katalytischen Domäne konnte sowohl unverändert wie auch als inaktive C866S-Mutante in einer hohen Auflösung aufgeklärt werden. Durch eine Überlagerung mit CNF1 wurde festgestellt, dass, neben einem identischen katalytischem Zentrum, auch die Tertiärstruktur beider Proteine gleich ist. Ein gemessener Datensatz vom Volllängeprotein führte aufgrund fehlender Phaseninformation bisher zu keiner Strukturaufklärung. Die Darstellung des Komplexes zwischen CNFy und der kleinen GTPase RhoA erwies sich ebenfalls als schwierig. Dennoch wurde anhand einer verschobenen SDS-Gel Bande, die Deamidierung von RhoA durch das rekombinant erzeugte CNFy nachgewiesen. Später konnte der Komplex zwischen RhoA und CNFy mit Hilfe eines berechneten Models von CNF1 und RhoA modelliert werden. Durch die Strukturen, das modellierte Komplexmodell mit RhoA und die biochemische Daten, die während des Aktivitätstestes aufgenommen wurden, konnte das Wissen über diese Proteinfamilie ergänzt und Grundlagen für weitere Untersuchungen geschaffen werden.

Yersinia cytotoxic necrotizing factor (CNFy) is a recently discovered AB-toxin essential for the invasion process of Yersinia. Due to its ability to deamidate and thereby constitutively activate small Rho-GTPases CNFy was combined with CNF1 to CNF3 of E. coli and the dermonecrotic toxin (DNT) of Bordetella in the protein family called cytotoxic necrotizing factors (CNF). The catalytic domain of CNF1, which is used as model protein for this protein family, was crystallized and data regarding specificity and activity were collected in vitro and in vivo. To define common protein family features and complement as well as extend the existing knowledge about the activity and uptake of the different CNF members structural and biochemical data of CNFy were collected and analyzed within the scope of this thesis. Initially, various constructs were designed from a CNFy full-length plasmid, which was kindly provided by our cooperation partner Prof. Dr. Petra Dersch (HZI Braunschweig). These new constructs were tested for protein stability during recombinant expression and purification. The protocols for a few promising constructs were optimized. Pure proteins were used in screening for suitable crystallization conditions. Conditions showing crystals were optimized and x-ray datasets were recorded for the full-length CNFy as well as for its catalytic domain. The CNFy catalytic domain x-ray structure was solved at high resolutions for the wild type (WT) and an inactive C866S mutation. These CNFy structures, superposed with the catalytic domain of CNF1, confirm an identical overall fold and catalytic triad between these two family members. After different trials to obtain phases for a 3.2 Angström dataset of the full-length CNFy this structure remained unsolved. Furthermore, despite difficulties in showing the complex between the small GTPase RhoA and CNFy with ITC, OctetRED or pull-down assays, the activity of the recombinant expressed CNFy could be shown in a SDS-Gel-shift assay. The complex between CNFy and RhoA was created using a modeled complex of CNF1 and RhoA. The solved x-ray structures, the modeled interaction of a possible CNFy-RhoA complex and the biochemical data obtained from the activity tests during the present work complements the knowledge of this protein family and generate good basis for future research

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Heidler, Thomas Volker: Structural investigation of the Yersinia pseudotuberculosis AB-toxin CNFy. 2015.

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