Membrane-associated higher-ordered protein mega-complexes for denitrification and motility in Pseudomonas aeruginosa

Borrero de Acuna, José Manuel

Die ubiquitär vorkommende Bakteriengattung Pseudomonas wurde zur Untersuchung von Fragen der Grundlagenforschung und angewandten Mikrobiologie verwendet. Zuerst diente Pseudomonas aeruginosa diente als Studienobjekt zur Identifizierung und funktioneller Chakterisierung Membran-assoziierter hochmolekularer Proteinkomplexe, die in der Energiegewinnung und in der Motilität involviert sind. Unter Verwendung eines kombinierten affinitätschromatographischen und proteomischen Ansatzes wurde der Megakomplex der Denitrifikation, der die Umsetzung von Nitrat über Nitrit, NO, N2O zu molekularem N2 katalysiert, isoliert und seine Proteinkomposition aufgedeckt. Es wurde entdeckt, dass alle vier Enzyme der Denitrifikation (Nar, Nir, Nor and Nos) und zusätzliche Proteine assemblieren an einer Membran-verankerten Plattform bestehend aus NorBC und NosR andocken. Übereinstimmend zeigten Mutantenstämme von norBC und nosR verminderte oder nahezu keine Denitrifikationsaktivität. Weiterhin waren verschiedene Elektron-spendende Enzyme der Kofaktorbiosynthese, des Proteinexports, sowie das komplette ATP Synthasesystem und viele andere Komponenten Teil des Megakomplexes. Gefundene Protein-Protein-Interaktionen wurden mittels Elektronenmikroskopie bestätigt. Interessanterweise wurde durch einen ähnlichen Ansatz im Periplasma von P. aeruginosa ein trimärer Komplex bestehend aus der Nitritreduktase NirS, dem Flagellenprotein FliC und dem Chaperone DnaK detektiert. Die zelluläre Lokalisation dieser drei Proteine wurde mittels Elektronenmikroskopie visualisiert und Proteindomänen von NirS, die für die Protein-Proteininteraktion mit FliC verantwortlich sind, identifiziert. Die exakte biologische Funktion dieses Komplexes, möglicherweise für die Assemblierung des Flagellums, gilt es noch zu aufzuklären. Zum Schluß wurde P. putida für eine Optimierung der PHA Produktion verwendet, die auf einer in silico metabolomischen Modellierung basierte. Zu diesem Zweck wurde die durch das acoA-Gen kodierende Pyruvatdehydrogenase erfolgreich rekombinant überproduziert. So konnte in Kombination mit einem Glucose Dehydrogenase (gcd) Gen-defizientem P. putida Hintergrund die PHA Produktion auf 120% gesteigert werden. Der funktionelle Hintergrund für diese Produktionssteigerung wurde über Transkriptions- und NADH/NAD+- Analysen eingehend untersucht. Zusammenfassend liefert diese Dissertation erstmals den Nachweis für die Existenz eines bakteriellen Respirasoms welches direkt an die Motilität von P. aeruginosa gekoppelt ist.

The two bacterial species of the genus Pseudomonas were used during to investigate questions of fundamental and applied microbiology. Pseudomonas aeruginosa served as target for the identification and functional characterization of membrane-associated higher ordered protein complexes involved in anaerobic energy generation and motility. Using a combined affinity chromatography and proteomic approach the mega-complex for anaerobic denitrification, the conversion of nitrate via nitrite, NO, N2O to molecular N2, was isolated and its composition elucidated. All four enzymes of denitrification (Nar, Nir, Nor and Nos) and multiple accessory proteins were assembled at a membrane anchored platform consisting of NorBC and NosR. In agreement, mutants of norBC and nosR revealed abolished or hampered overall denitrification. Furthermore, various electron donating enzymes systems of cofactor biosynthesis, proteins export, the complete ATP synthase and multiple other compounds were part of the mega-complex. Protein-protein interactions were confirmed by electron microscopy. Interestingly, a trimeric complex of the nitrite reductase NirS, the flagella protein FliC and the chaperone DnaK were detected by a similar experimental approach in the periplasm of P. aeruginosa. Mutants of nirS revealed a defect in swimming motility. The cellular location of the three proteins was visualized by electron microscopy and protein domains of NirS responsible for protein-protein interaction with FliC were identified. The exact biological function of the complex, possibly in flagellum assembly, remains to be determined. Finally, P. putida were employed for the in silico metabolic modeling based directed optimization of PHA production. For this purpose the acoA gene encoding pyruvate dehydrogenase was successfully overexpressed. Combination with a glucose dehydrogenase gene (gcd) deficient genetic background enhanced PHA production by 120%. The functional background for the observed improvement was fully investigated by transcriptome and NADH /NAD+ ratio analysis. In summary, this thesis provides for the first time evidences for the existence of a bacterial respirasome which seems to directly be coupled to motility.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Borrero de Acuna, José Manuel: Membrane-associated higher-ordered protein mega-complexes for denitrification and motility in Pseudomonas aeruginosa. 2015.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export