Untersuchungen zum Aufbau der Stroma-Biomatrix cornealer Zellkulturmodelle für In-vitro-Arzneistoffabsorptionsuntersuchungen und zur Gewebe-rekonstruktion

Grobe, Gesa Maria

Corneale Zellkulturmodelle haben in den letzten Jahren sowohl für Fragestellungen der Bioverfügbarkeit von Ophthalmika als auch in der regenerativen Augenheilkunde an Bedeutung gewonnen. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Weiterentwicklung eines bereits etablierten humanen Cornea-Modells für In-vitro-Arzneistoffabsorptionsuntersuchungen. Nach erfolgreicher Optimierung des Kultivierungsprotokolls hinsichtlich der Verwendung von ausschließlich immortalisierten Zelllinien wurde die Eignung der in der Ophthalmologie eingesetzten Riboflavin/UVA-Methode untersucht, um über eine Collagen-Quervernetzung eine Verfestigung der Stromabiomatrix des Cornea-Modells zu induzieren. Nach der Behandlung konnte durch oszillationsrheologische Messungen eine geringe, aber statistisch signifikante Verbesserung der viskoelastischen Eigenschaften der Stromabioäquivalente festgestellt werden. Allerdings zeigte die humane corneale Keratozytenzelllinie eine deutliche und nachhaltige, von der Bestrahlungsdosis abhängige Verminderung der Zellviabilität, wobei je nach applizierter Bestrahlungsdosis, apoptotische oder nekrotische Prozesse überwogen. Insgesamt erwies sich die Riboflavin/UVA-Methode, im Unterschied zur klinischen Anwendung, als ungeeignet für die Verfestigung der Stromabiomatrix des beschriebenen Cornea-Modells für In-vitro-Arzneistoffabsorptionsuntersuchungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden vergleichende Untersuchungen an Langzeitkulturen nativer und immortalisierter humaner cornealer Stromazellen zur Stimulation der Synthese extrazellulärer Matrix durch Vitamin C-Supplementierung durchgeführt. Beide Zellarten reagierten auf Vitamin C-Supplementierung mit einer gesteigerten Sekretion von Collagen, wobei der Effekt in den nativen Zellen stärker ausgeprägt war. Die Sekretion von Glykosaminoglykanen wurde hingegen nicht angeregt. In den nativen Zellen steigerte Vitamin C außerdem die Zellviabilität und -proliferation. Durch den Vitamin C-Zusatz entstanden zusammenhängende Zellsheets, wobei die Zellsheets der nativen Zellen eine höhere Lichttransmission, einen höheren Ordnungszustand der Collagenfibrillen und bessere biomechanische Eigenschaften zeigten als die Zellsheets aus immortalisierten Zellen. Insgesamt erscheint die Stimulation der Sekretion extrazellulärer Matrix in nativen cornealen stromalen Zellen als ein vielversprechender Ansatz für die Entwicklung eines cornealen Gewebeersatzes als Alternative zu begrenzt verfügbarer humaner Spenderhornhaut.

In recent years tissue engineered corneal models became more important in terms of bioavailability studies of ophthalmic drugs and regenerative ophthalmology. The first part of this thesis deals with the enhancements of an existing human corneal model for in vitro drug absorption studies. After the cultivation protocol was optimized successfully regarding the exclusive use of immortalized cell lines, the suitability of riboflavin/UVA-treatment, which is used in ophthalmology, was evaluated to strengthen the stroma biomatrix of the corneal model by inducing collagen crosslinking. After the treatment oscillation rheology experiments revealed a slight, but significant increase in viscoelastic properties of the stromal bioequivalents. However, the human corneal keratocyte cell line showed a considerable and enduring decline of cell viability, which was dependent on the applied dose of irradiation. Furthermore, it could be demonstrated that apoptotic and necrotic processes predominated depending on the applied dose of irradiation. Consequently, in contrast to clinical applications, riboflavin/UVA-treatment does not seem to be a suitable method to strengthen the stroma biomatrix of the corneal model for in vitro drug absorption studies. The topic of the second part of the thesis is the stimulation of extracellular matrix synthesis in long-term cultures via vitamin C supplementation comparing native and immortalized human corneal stromal cells. Collagen secretion was increased in both cell types as a result of vitamin C supplementation, whereas the effect was stronger in the native cells. However, vitamin C supplementation did not stimulate the secretion of glycosaminoglycans. Additionally, vitamin C supplementation had a positive effect on cell viability and proliferation in the native cells. Vitamin C supplementation induced the formation of coherent cell sheets. The cell sheets formed by the native cells had a higher percent of light transmission, a higher degree in regular arrangement of collagen fibrils and were superior in terms of biomechanical properties. Taken as a whole, stimulating secretion of the extracellular matrix in native corneal stromal cells is a promising approach for reconstructing the corneal stroma for tissue replacement as an alternative to limited human donor corneas.

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Grobe, Gesa Maria: Untersuchungen zum Aufbau der Stroma-Biomatrix cornealer Zellkulturmodelle für In-vitro-Arzneistoffabsorptionsuntersuchungen und zur Gewebe-rekonstruktion. 2015.

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