Die letzten Schritte der alternativen Häm-Biosynthese in Archaea: Charakterisierung der Proteine AhbA, AhbB, AhbC und des Radical SAM Enzyms AhbD aus Methanosarcina barkeri

Kühner, Melanie Theresia

Das zyklische Tetrapyrrol Häm ist für nahezu alle Lebewesen essentiell. In Eukaryoten wird Häm über einen Syntheseweg generiert, der seit längerem charakterisiert ist. In Sulfat-reduzierenden Bakterien sowie allen Häm produzierenden Archaea wurde ein alternativer Häm-Biosyntheseweg entdeckt. Dieser führt über die Intermediate Precorrin-2, Sirohydrochlorin, Sirohäm (SH), 12,18-Didecarboxysirohäm (DDSH) und Fe Coproporphyrin III (Fe-Copro III). In dieser Arbeit wurden die alternativen Häm-Biosyntheseproteine AhbAB, AhbC und AhbD aus dem methanogenen Archeon Methanosarcina barkeri funktionell charakterisiert. Durch in-vivo-Enzymtests konnte gezeigt werden, dass AhbA und AhbB (Mbar_A1459 und Mbar_A1460) SH zu DDSH umsetzen. AhbAB liegt als heterodimerer Komplex vor, der das Endprodukt Häm bindet und könnte daher an einem regulatorischen feedback-Inhibitionsmechanismus beteiligt sein. Ebenfalls wurde in vivo gezeigt, dass AhbC (Mbar_A1793) Fe-Copro III generiert. Rekombinant produziertes AhbD (Mbar_1458) aus M. barkeri wurde erfolgreich gereinigt und bindet zwei [4Fe 4S]-Cluster. Eine Umsetzung von Fe-Copro III zu Häm durch AhbD wurde in in vitro-Enzymtests erfolgreich nachgewiesen. Da es zu den Radical SAM (RS) Enzymen gehört, startet seine Katalyse durch Spaltung von S Adenosylmethionin (SAM) an einem der beiden [4Fe 4S]-Cluster zu einem 5‘-Deoxyadenosyl-Radikal. Durch Generierung von AhbD-Varianten, bei denen entweder die N-terminale bzw. die C-terminale Clusterbindung aufgehoben wurde, konnte durch SAM-Spaltungstests das N terminale Cluster in Anwesenheit von Fe-Copro III als RS-Cluster identifiziert werden. Das zusätzliche C terminale Cluster des AhbD konnte durch ESR- und CV-Messungen ebenfalls als redoxaktives Cluster identifiziert werden, was eine Rolle dieses Clusters für den Elektronentransfer bei einem späteren Reaktionsschritt wahrscheinlich macht. Substratbindungstests sowie Enzymtests mit Substratanaloga zeigten, dass keines der Cluster für die Substratbindung essentiell ist, jedoch das zentrale Metallatom des Substrates für die vollständige Bildung des Produkts von Bedeutung ist. Weiterhin wurde das AhbD-Homolog aus Metallosphaera sedula (Msed_0512) erfolgreich gereinigt und kristallisiert, wobei erste hexagonale kristalline Strukturen beobachtet wurden.

The cyclic tetrapyrrole heme is essential for almost all living organisms. In eukaryotes heme is synthesized via a well-characterized pathway. An alternative pathway was found to be operative in sulfate-reducing bacteria and all heme-producing Archaea. In this pathway the intermediates precorrin-2, sirohydrochlorin, siroheme (SH), 12,18-didecarboxysiroheme (DDSH) and iron-coproporphyrin III (Fe-copro III) are formed, which are not part of the classical heme biosynthesis route. In this work, the alternative heme biosynthesis proteins from the methanogenic archeon Methanosarcina barkeri AhbAB, AhbC and AhbD were functionally characterized. In vivo enzyme assays showed, that AhbA and AhbB (Mbar_A1459 and Mbar_A1460) convert SH into DDSH. AhbAB form a heterodimeric complex, which is able to bind the end-product heme. Thus, a role for AhbAB in a regulatory feedback mechanism might be possible. Further, AhbC (Mbar_A1793) was shown to catalyze the conversion of DDSH into Fe copro III in vivo. Recombinantly produced AhbD (Mbar_1458) from M. barkeri was purified indicating the binding of two [4Fe 4S] clusters. The conversion of Fe-copro III into heme by the action of AhbD was confirmed by in vitro enzyme assays. AhbD belongs to the Radical SAM (RS) enzymes and its catalysis starts with the cleavage of S adenosylmethionine (SAM) into a 5‘ deoxyadenosyl radical at one of the [4Fe 4S] clusters. By generation of cluster variants, which are able to bind either the N terminal or the C-terminal cluster, the N-terminal cluster was identified as the only Radical cluster in AhbD using SAM cleavage assays with Fe copro III. The auxilliary C-terminal cluster was shown to be redox-active with EPR and CV measurements. Since it is also essential for the enzyme’s overall activity these measurements indicated a role for the cluster in electron transfer. Studies for substrate binding and enzyme assays using substrate analogs showed, that the cluster is not essential for substrate binding. The central metal ion of the substrate is important for a complete conversion of substrate. Additionally, the homolog of AhbD from Metallosphaera sedula (Msed_0512) was also purified and crystallized. First crystal-like hexagonal structures were obtained for the first time.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Kühner, Melanie Theresia: Die letzten Schritte der alternativen Häm-Biosynthese in Archaea: Charakterisierung der Proteine AhbA, AhbB, AhbC und des Radical SAM Enzyms AhbD aus Methanosarcina barkeri. 2015.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export