Generierung neutralisierender Antikörper gegen Botulinum Neurotoxin Serotyp A

Miethe, Sebastian

Botulismus ist eine akute, lebensbedrohliche Erkrankung, ausgelöst durch eine Intoxikation mit Botulinum Neurotoxine (BoNTs), welche von Clostridium botulinum und weiteren Clostridium spp. sekretiert werden. Bisher sind 8 Serotypen (A-H) von BoNT bekannt, von denen Serotyp A, B, E und in seltenen Fällen Serotyp F für den humanen Botulismus verantwortlich sind. Aufgrund ihrer Toxizität wurden BoNTs vom Centers of Disease Control and Prevention (CDC) als potenzielle Biowaffen der Kategorie A klassifiziert. BoNT/A gilt als die giftigste Substanz mit einem LD50 Wert (Letale Dosis) von 1 ng/kg intravenöser und subkutaner Applikation bzw. 3 ng/kg pulmonaler Applikation. Bisherige Therapieansätze beruhen auf einer passiven Immunisierung mit Pferdeantiserum bzw. im Fall von Säuglingsbotulismus mit dem humanen Antikörperpräparat BabyBig. Allerdings sind die Vorräte des Humanpräparates limitiert und die Verwendung von Pferdeantiserum birgt das Risiko einer Hypersensitivitätsreaktion. In dieser Arbeit wird die Generierung neutralisierender Antikörper gegen BoNT/A1 beschrieben. Ausgangspunkt war die Immunisierung eines Makaken mit der leichten Kette von BoNT/A1 und die Generierung einer Antikörpergenbibliothek zur Selektion von BoNT/A1 spezifischer Antikörper mittels der Phagen Display Technologie. Der Antikörper mit der besten Toxin-Neutralisation wurde mittels Germlinization humanisiert. Insgesamt wurden 22 Antikörper selektiert, von denen 7 die Toxizität von BoNT/A1 in ex vivo neutralisierten. Die beste Neutralisation wurde für SEM120‑IIIC1 beschrieben. Durch die Humanisierung von SEM120-IIIC1 wurde der Germinality Index (GI) von insgesamt 87,2 % auf 94,5 % gesteigert. Die Antigenbindung von SEM120-IIIC1 zu BoNT/A1 wurde durch die Humanisierung nicht beeinträchtigt. Die Affinität von SEM120-IIIC1 betrug als scFv-Fc 0,82 nM. Die humanisierte Variante hu8SEM120-IIIC1 besaß eine Affinität von 1,41 nM. Des Weiteren war hu8SEM120-IIIC1 als IgG (1 µg/Dosis) im in vivo Paralyse Assay mit BoNT/A1 (0,4LD50) protektiv. Zusammen mit hu8A1Hc38 stellte sich ein Synergieeffekt ein, bei dem beide Antikörper bei einer Konzentration von 0,25 µg/Dosis die Toxizität von BoNT/A1 vollständig neutralisierten. Dieser Synergieeffekt wurde im in vivo Maus Letalitäts Assay bestätigt, bei dem sämtliche Versuchstiere eine Intoxikation von BoNT/A1 (5MLD50) bei einer Antikörperkonzentration von 2,5 µg/Maus überlebten.

Botulism is a life-threatening disease caused by an intoxication of several Botulinum neurotoxins (BoNTs) that are secreted by Clostridium botulinum and certain other Clostridium spp.. To date, there are 8 serologically distinct serotypes (designated A to H) of BoNT known. Four BoNT serotypes (A, B, E and rarely F) are mainly responsible for human botulism. Due to the high toxicity BoNTs are classified as category A agents by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and are among of the six agents with the highest risk of potential use as bioweapons. BoNT/A is the most toxic substance on earth with LD50 values (lethal dose) of 1 ng/kg by the intravenous and subcutaneous routes and 3 ng/kg by the pulmonary route. The current approach for the treatment of botulism is based on passive immunization with equine anti-toxin serum or in case of infant botulism with human anti-botulism immunoglobulines, such as BabyBig. Nevertheless, the use of equine anti-toxin serum may cause hypersensitivity and serumsickness and the human serum stock of BabyBig is limited. In this study, the development of neutralizing antibodies against BoNT/A1 is described. Therefor, a male macaque was immunized with BoNT/A1 (light chain). Afterwords, an immune phage display library was constructed and used for selection of BoNT/A1 specific antibodies. After multi-step panning 22 scFv were selected. Seven antibodies were neutralizing in ex vivo. SEM120-IIIC1 was the most promising candidate for further development and was used for humanization. The human-like nature of this antibody, given by the germinality index (GI), was increased by germlinization from 87.2 % up to 94.5 %. It was shown that the affinity of SEM120-IIIC1 was not significant changed by humanization. The affinity of the macaque antibody as scFv-Fc was 0.82 nM and correlates with the affinity of the humanized antibody hu8SEM120-IIIC1 (1.41 nM). Furthermore, hu8SEM120-IIIC1 was partial protective in vivo (0.4LD50 BoNT/A1) as IgG at 1 µg/dose and a synergistic effect was observed in combination with hu8A1Hc38. Both antibodies are completely protective in vivo against BoNT/A1 at 0.25 µg/dose per antibody. The synergistic effect was clarified using the in vivo mouse lethality assay. Here, all animals treated with BoNT/A1 (5MLD50) survived after medication with 2,5 µg/mouse of hu8SEM120-IIIC1 and hu8A1Hc38.

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Miethe, Sebastian: Generierung neutralisierender Antikörper gegen Botulinum Neurotoxin Serotyp A. 2015.

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