Integration of Reaction and Product purification for trienzymatic catalyzed synthesis of Laminaribiose from Sucrose

Zein, Marwan

In der vorliegenden Arbeit wurde Laminaribiose in einem One-pot Prozess untersucht. Sucrose ist das Substrat, die Synthese erfolgte durch sucrose phosphorylase (SP), glucose isomerase (GI), und laminaribiose phosphorylase (LP). Es dient auch als Modelsystem für multienzymatische Prozesse. Für eine kontinuierliche Prozessführung wurde die Immobilisierung der Enzyme mit Chitosan-Polyphosphat sowie Agar untersucht. LP wurde durch Euglena gracilis kultiviert und optimiert, durch heterotrophe Kultivierung bei 33°C, mit Citronensäure-Phosphatpuffer bei pH 4.1. LP konnte nach 96 Stunden durch Ultraschallaufschluss geerntet werden, mit 0.52g/l pro Kulturvolumen. Aufreinigung und Aufkonzentration der LP Suspension wurde durch Ammoniumsulfatfällung (30%-60% Sättigung) und anschließender Dialyse erhalten. Aufgereinigtes LP existiert als Monomer und Dimer mit Molekularmassen von 120kDa und 250kDA. Höchste katalytische Aktivität der LP liegt zwischen 42°C-45°C bei pH 6,2. Die Doppelsubstratkinetik wurde mit den Reaktionen zu den höheren Oligomeren erweitert um ein kinetisches LP Model zu beschreiben. Die Kinetik hängt vom Glucose/Glucose-1-Phosphat Verhältnis ab. Ein Verhältnis größer als 2 verursacht eine Verschiebung der Produkte zu Laminarbiose. Optimale Reaktionsbedingungen für SP sind bei 45°C-50°C und pH 7,0. Das Reaktionsmodel wird durch eine Doppelsubstratkinetik mit Substratinhibierung beschrieben. GI folgt einer reversiblen Monosubstratkinetik mit optimalen Reaktionsbedingungen bei 60°C und pH 8,5. Das trienzymatische System hat optimale Bedingungen bei 45°C mit pH 6,2. Laminaribiosebildungen sind geringer als die Bildung der höheren Oligomere. Die Reaktion wird durch Kombination von Mono-/Bisubstratkinetiken sehr gut beschrieben. Um aufgereinigte Produkte zu erhalten und zur Reduzierung der Bildung von höheren Oligomeren wurde eine reaktionsintegrierte Produktentfernung (engl. in situ product removal) mit BEA150 als Adsorbens etabliert. Dadurch konnte Laminaribiose annähernd vollständig von der Reaktionslösung entfernt werden. Die Immobilisierung der Enzyme in einer Chitosan/Polyphosphatmatrix sowie Agarmatrix war erfolgreich, mit guten Enzymaktivitäten. Enzyme in Agar verfügen über eine höhere Aktivität als in Chitosan/Polyphosphat und sollten daher für die Etablierung eines immobilisierten trienzymatischen/ISPR Systems eingesetzt werden. Die erfolgreiche Produktion von Laminaribiose durch ein immobilisiertes trienzymatischen System konnte bestätigt werden.

In this thesis, sucrose is a substrate for sucrose phosphorylase (SP), glucose isomerase (GI), and laminaribiose phosphorylase (LP) to produce laminaribiose via a one-pot process. This trienzymatic reaction serves also as a model system for multienzymatic processes. For a continuous process, immobilization with matrix entrapment by chitosan-polyphosphate and agar was studied.LP was cultivated and optimized using Euglena gracilis. Optimal growth conditions for the production are accomplished by heterotrophic cultivation at 33°C with a citric acid phosphate buffer (pH 4.1). LP is harvested after 96 hours by using ultrasonic disintegration with yields of 0.52g/l per culture volume. Ammonium sulfate precipitation (30%-60% saturation) followed by dialysis, is suitable for purification and concentration of LP. Purified LP solution exists as monomer and dimer with molecular masses of 120kDa and 250kDa respectively.LP has optimal working conditions between 42°C-45°C at pH 6.2. A double substrate mechanism was extended to include the subsequent reactions to higher oligomers as a reaction model for LP kinetics. Kinetics are dependent on glucose/glucose-1-phosphate ratios. Ratios greater than 2 shift the products towards laminaribiose. Optimal reaction conditions for SP were found at a temperature of 45°C-50°C at pH 7.0. The reaction was modeled with double-substrate kinetics with substrate excess inhibition. Best reaction conditions for GI were found at 60°C-80°C with pH 8.5, the reaction was modeled with reversible monosubstrate kinetics.ith regards to the trienzymatic system, a temperature of 45°C and a pH of 6.2 represent optimal operating conditions. Laminaribiose formation was surpassed by subsequent reactions which lead to the formation laminaritriose and laminaritetraose. The trienzymatic system is well described by combination of mono-/bienzymatic kinetics. To obtain purified products and minimize side reactions, an in-situ product removal (ISPR) system was established, with BEA150 used as an adsorbant. Nearly all of laminaribiose was removed from the reaction mixture.The immobilizations of all enzymes within a chitosan/polyphosphate matrix and agar matrix entrapment were both successful showing good enzymatic activities. Comparison of the two techniques showed that agar is to be favored for establishing an immobilized trienzymatic/ISPR system. A trienzymatic system with the enzymes immobilized in agar showed a production of laminaribiose.

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Zein, Marwan: Integration of Reaction and Product purification for trienzymatic catalyzed synthesis of Laminaribiose from Sucrose. 2014.

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