Analyses of sigma factor-associated regulatory networks in Pseudomonas aeruginosa

Schulz, Sebastian

Ein Schlüsselmerkmal lebender Bakterien ist ihre herausragende Anpassungsfähigkeit an sich ändernde Umweltbedingungen. Dabei spielt die Regulation der Transkription von Genen eine entscheidende Rolle. In Bakterien vermitteln Sigma-Faktoren die sequenzspezifische Erkennung von Promotoren durch die RNS-Polymerase und nehmen damit eine Schlüsselfunktion bei der internen Umsetzung einer adäquaten Signalantwort ein. Das Ziel dieser Arbeit war es, die regulatorischen Netzwerke von 10 alternativen Sigma-Faktoren im opportunistischen Krankheitserreger Pseudomonas aeruginosa zu entschlüsseln. Zu diesem Zweck wurden die Sigma-Faktor Regulons durch RNA-Sequenzierung von Stämmen mit Sigma-Faktor Deletion und Überexpression bestimmt. Ein hierarchisches Clustern der 10 Regulons ergab eine modulare Organisation der globalen Genexpression, bei der 2/3 der Gene ausschließlich von einem bestimmten Sigma-Faktor reguliert wurden, während 1/3 der Gene unter der Kontrolle von 2 oder mehr Sigma-Faktoren standen. Zur Bestimmung der primären Sigma-Faktor Regulons wurden die Transkriptomanalysen mit Chromatin-Immunopräzipitation gekoppelt mit Hochdurchsatz-Sequenzierung sowie mit Motivscans der de novo identifizierten Sigma-Faktor Bindungsmotive ergänzt. Die funktionelle Charakterisierung der primären Regulons ergab eine hohe Übereinstimmung mit den bekannten Funktionen der Sigma-Faktoren. Desweiteren zeigte die Analyse eine Anreicherung von Genen mit grundlegenden Zellfunktionen in der indirekten Wechselwirkung der Sigma-Faktoren, während Gene, die direkt von 2 oder mehr Sigma-Faktoren reguliert wurden, verstärkt an Anpassungsprozessen beteiligt waren. Zudem wurde RpoN als der dominante Sigma-Faktor identifiziert. Anschließend wurde das Netzwerkverhalten unter 14 unterschiedlichen Umweltbedingungen untersucht. Diese Analyse ergab eine hohe Robustheit der Netzwerke. Weiterhin zeigten die Transkriptomanalysen von 6 P. aeruginosa Mutantenstämme mit inaktivierten Transkriptionsfaktoren spezifische und selektive Verknüpfungen der alternativen Sigma-Faktor Regulons durch Transkriptionsfaktoren als Antwort auf komplexe Umweltbedingungen. Die vorliegende Arbeit trägt somit wesentlich zum Verständnis bei, wie Bakterien sich an ihre Umwelt anpassen können. Diese Anpassungsfähigkeit basiert hauptsächlich auf robusten und distinkten Modulen durch Sigma-Faktor Regulons sowie der präzisen Modulation der Transkription durch die flexible Vernetzung dieser Module durch Transkriptionsfaktoren.

A hallmark of living bacteria is their sophisticated ability to adapt to changing environments. Within this process, the regulation of gene transcription is of major importance. In bacteria, sigma factors provide promoter recognition specificity to the RNA polymerase and thus are the pivotal point in mediating an adequate internal response to external cues. The aim of this thesis was to uncover the regulatory networks of 10 major alternative sigma factors in the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa. The cognate sigma factor regulons were determined by RNA-sequencing of sigma factor deletion mutant and hyper-expressing strains. A hierarchical cluster analysis of the 10 regulons revealed a modular organization of global gene expression with 2/3 of the genes being under the exclusive direction of one specific sigma factor, whereas 1/3 of the genes were under control of 2 or more sigma factors. To define the primary regulon of each sigma factor, transcriptional profiling was complemented with chromatin immunoprecipitation coupled to high-throughput sequencing as well as motif scans of the de novo elucidated sigma factor binding motifs. Functional profiling of these primary regulons was in high accordance with known sigma factor functions. Furthermore, the analysis of the sigma factor cross talk revealed an enrichment of genes which are linked to fundamental cellular processes within the indirect cross talk, while genes which were directly targeted by 2 or more sigma factors were mainly involved in processes associated with adaptation. Moreover, RpoN was identified to be the major player within the sigma factor cross talk. Then, the functional state of the sigma factor-associated regulatory networks was investigated under 14 different growth conditions. This analysis demonstrated the robustness of these networks. Moreover, the transcriptome analysis of 6 P. aeruginosa mutant strains with inactivated transcriptional regulators revealed specific and selective interconnectivity of alternative sigma factor regulons by transcription factors to cope with complex and challenging environments. This thesis significantly advances our understanding of how bacteria are able to adapt to changing environments. This adaptability is mainly based on robust and distinct modules provided by sigma factor regulons and the fine-tuned modulation of transcription provided by the flexible connection of these modules by transcription factors.

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Schulz, Sebastian: Analyses of sigma factor-associated regulatory networks in Pseudomonas aeruginosa. 2014.

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