Development of conformation specific Amyloid-beta antibodies

Droste, Patrick Bernhard Herbert

Die Alzheimer Erkrankung (AD) ist die Hauptursache für Demenzerkrankungen in der älteren Bevölkerungsschicht und betrifft weltweit 35 Millionen Menschen. Durch Demenzerkrankungen entstehende Kosten werden in den nächsten 15 Jahren voraussichtlich auf über 1,1 Billionen US $ steigen. Die Neurodegeneration, die der AD zugrunde liegt, wird wahrscheinlich ausgelöst durch die Verschiebung des Gleichgewichts zwischen der Produktion und Beseitigung von Amyloid-beta (AB). Bei erhöhten Konzentrationen aggregiert AB zu Plaques und löst neuronale Fehlfunktionen aus. Die derzeitige Diagnose der AD beruht vor allem auf kognitiven Tests und verschiedenen bildgebenden Verfahren, wodurch allerdings nur eine weit vorangeschrittene Erkrankung identifizierbar ist. Um AD in einem frühen Stadium zu erkennen ist es unerlässlich, einen Einblick in die der Krankheit zugrunde liegenden Prozesse im Gehirn zu erlangen, und das Aggregationsverhalten von AB zu erforschen. Antikörper (AK), die zwischen Aggregaten von AB wie Monomeren, Oligomeren oder Fibrillen differenzieren, können in Zukunft helfen Lücken im derzeitigen Verständnis der AD zu schließen. Das Ziel dieser Arbeit war es, konfirmationsspezifische AK zu generieren, die eben diese Aufgabe erfüllen, und sie mit Hilfe von biochemischen und biophysikalischen Methoden zu charakterisieren. Hierfür wurden zwei AB42 spezifische Phagen-Display-AK-Bibliotheken generiert und zusammen mit zwei naiven Bibliotheken auf Binder untersucht. Es wurden acht scFvs gewonnen, ins scFv-Fc Format überführt und anschließend in beiden Formaten in Mammalia-Zellen produziert. Fünf dieser AK wurden in ausreichenden Konzentrationen für weitere Experimente produziert. Die AK banden an unterschiedliche Epitope von AB42 und wiesen Affinitäten zu mehreren Aggregaten im mikromolarem bis nanomolarem Bereich auf. Drei der untersuchten AK zeigten eine generelle Spezifität zu AB, während zwei AK bestimmte Formen bevorzugten. PaD213-A5 ist hochspezifisch für AB42 Fibrillen und kann zwischen unterschiedlichen fibrillären Strukturen unterscheiden, wohingegen PaD233-E5, obwohl dieser AK alle AB Aggregate detektierte, eine 100fach erhöhte Affinität zu AB42 Monomeren aufwies. Außerdem wurde der AK-Einfluss auf die Aggregation und Toxizität von AB42 in vitro untersucht, wobei PaD97-D6, PaD233-E5 und PaD236-H2 eine Inhibierung der Fibrillogenese herbeiführten und alle scFvs den hemmenden Einfluss von AB42 auf den Zellmetabolismus von SH-SY5Y Zellen verringerten.

Alzheimer's Disease (AD) is the major cause of dementia in the elderly with over 35 million people suffering as of 2012. The total annual costs generated by dementia are expected to rise to more than 1,100 billion $ within the next 15 years. The main cause of the neurodegeneration in AD is believed to be due to a shift in the equilibrium between production and clearance of Amyloid-beta (AB). When produced in excess, AB aggregates to amyloid plaques and causes neuronal dysfunction. The current diagnosis of AD is performed by cognitive function tests and imaging methods that can only detect advanced neuronal degradation. For an accurate identification of the disease at an early stage it is essential to get insight on the biological processes in the brain of AD patients and monitor the aggregation of AB under physiological conditions. Highly selective antibodies that can distinguish between the different forms of AB monomers, oligomers and mature fibrils can fill the gap that still exists in the current understanding of AD. The objective of this work was to generate conformational specific antibodies that fulfill these goals and characterize their biochemical and biophysical properties. For this, two AB42 specific phage display libraries were constructed and screened together with two established naive human libraries for selective binders. Eight individual scFvs were obtained, transferred into the scFv-Fc format and produced in both formats in mammalian cells. Five antibodies were produced in sufficient amounts for additional assays. These scFvs detected different epitopes in AB42 and exhibited affinities to various aggregates in the micromolar to nanomolar range. While three of the five scFvs investigated demonstrated a general specificity towards AB, PaD213-A5 and PaD233-E5 presented a tendency to certain forms of AB42. PaD213-A5 is highly specific for mature AB42 fibrils and was able to distinguish between various fibrillar structures depending on the acidity of the surrounding milieu during fibrillogenesis while PaD233-E5, albeit binding also oligomers and fibrils, showed a 100fold increased affinity towards monomers. Further assessment of the impact on aggregation and toxicity in vitro determined that PaD97-D6, PaD233-E5 and PaD236-H2 are able to inhibit the formation of AB42 fibrils from monomers in a concentration dependent manner and all antibodies were able to rescue the negative effect of AB42 on the metabolism of SH-SY5Y cells.

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Droste, Patrick Bernhard Herbert: Development of conformation specific Amyloid-beta antibodies. 2014.

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