Die Rolle der Transkriptionsfaktoren Nkx2.2 und Nkx2.9 in der Entwicklung des Neuralrohrs: Herstellung einer Nkx2.9 Cre knock-in Mausmutante

Pravemann, Jana

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der beiden Transkriptionsfaktoren (TF) Nkx2.2 und Nkx2.9 während der Embryonalentwicklung mit Schwerpunkt des prospektiven Rückenmarks analysiert. Ein Aspekt der Arbeit bestand in dem Generieren und Analysieren einer Nkx2.9 Cre-Mausmutanten. Mit Hilfe dieser Mutante sollen die Zelllinien ventraler Vorläuferpopulationen dauerhaft markiert werden. Durch den Vergleich mit einer sehr ähnlichen Nkx2.2 Cre-Mausmutante konnte gezeigt werden, dass beide Nkx2-TF während der Embryonalentwicklung in der Bodenplatte (FP), der p3-Domäne und den daraus hervorgehenden V3-IN exprimiert werden. Beide Cre-Mauslinien wurden in den mT/mGFP- Reporterstamm eingekreuzt. Über die GFP-Expression konnte gezeigt werden, dass die Zelllinien beider Nkx2-TF nicht völlig identisch sind. Während die Zellen der Bodenplatte in heterozygoten Nkx2.9 Cre;mT/mGFP- Mutanten zwischen den analysierten Entwicklungsstadien E9,5 und E14,5 GFP-positiv sind, geht die GFP-Expression in der ventralsten Region des Neuralrohrs in Nkx2.2 Cre-Mutanten über den gleichen Zeitraum verloren. Zum anderen ließen sich Abkömmlinge der Nkx2.9-Linie weder in Vorläuferzellen der Oligodendrozyten noch in pankreatischem Gewebe nachweisen. Während der Analyse der Nkx2.9 Cre-Mutante wurden GFP-exprimierende Zellen auch in Olig2-positiven pMNs und MN detektiert. In Nkx2.2-/-;Nkx2.9-/--Mutanten wird neben dem p3-Verlust auch eine ventrale Expansion der MN und ein Defekt der FP beobachtet. Die MN-Zunahme ist bereits in der homozygoten Nkx2.2-Mutante nachweisbar. Mit Hilfe der Nkx2.2 Cre-Mauslinie konnte die Transformation einiger p3-Zellen zum pMN-Schicksal in Nkx2.2-Mutanten gezeigt werden. Ein anderer Aspekt war die Untersuchung der Wegfindungsstörungen kommissuraler Axone in Nkx2.2-/-;Nkx2.9-/--Mutanten, die scheinbar auf den Defekt der FP und den dort exprimierten Molekülen zurückzuführen sind. Die Analyse der veränderten Projektion erfolgte mittels IHC, in vitro-Kultivierung und mittels micro array. Eine deutliche veränderte Expression klassischer Wegfindungsmoleküle konnte im Zuge einer Transkriptomanalyse (E12,5) nicht gezeigt werden, obwohl zum Zeitpunkt E10,5/ E11,5 bereits belegt wurde, dass einige Moleküle in den DKO schwächer exprimiert werden. Ob weitere der in Nkx2.2-/-;Nkx2.9-/--Mutanten regulierten Gene in dem Prozess der axonalen Wegfindung eine Rolle spielen, bleibt bislang unklar.

The topic of this PhD-thesis was the study of both transcription factors Nkx2.2 and Nkx2.9 and their role in embryonic neural tube development. One challenge was the generation and analysis of a Nkx2.9 Cre knock-in mutant mouse strain, allowing the lineage tracing of progenitor cells in the ventral spinal cord. In a comparative analysis of this mutant and a similar Nkx2.2 Cre mutant mouse, overlapping expression domains were identified in the floor plate (FP), p3- domain and V3 IN. Both Cre strains were crossed to the mT/mGFP Cre reporter mouse. The GFP expression reveals that the cell fates of both Cre lines are not completely equal: while FP cells in heterozygous Nkx2.9 Cre;mT/mGFP mice are GFP positive during the development between E9,5 and E14,5, the detection of GFP in the ventral most region of the spinal cord in Nkx2.2 Cre;mT/mGFP mice gets lost over that time span. Furthermore Nkx2.9 descendants were neither found in the cell line of oligodendrocyte precursors nor in pancreatic tissue. During the analysis of the Nkx2.9 Cre mutant GFP expressing cells were also detected in some Olig2 positive pMNs and postmitotic MN. In addition to the loss of V3 IN in Nkx2.2-/-;Nkx2.9-/- double mutants, a ventral expansion of MN and a FP defect was observed in these mice. The increase in MN is already seen in homozygous Nkx2.2 mutants and it is postulated that p3 cells adopt a MN fate in these mutant mice. This transformation was shown by immunohistochemical analysis of Nkx2.2Cre/Cre;ROSA26+/mTmGFP mutant embryos. Another issue was the analysis of pathfinding defects observed in Nkx2.2-/-;Nkx2.9-/- mutant mice that seems to be due to the defective FP. The examination of the altered behavior of commissural axons is done by histological staining, in vitro tissue explants and via micro array. The latter did not show any clear changes in the expression level of cannonical guidance molecules in E12.5 dpc embryos. This is in contrast to published data were in situ hybridizations reveals lower expression of some guidance molecules in DKO mice at E10.5 and E11.5. If any of the other regulated genes in the analyzed Nkx2.2-/-;Nkx2.9-/- mutants could be involved in the process of axonal guidance is still unclear.

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Pravemann, Jana: Die Rolle der Transkriptionsfaktoren Nkx2.2 und Nkx2.9 in der Entwicklung des Neuralrohrs: Herstellung einer Nkx2.9 Cre knock-in Mausmutante. 2014.

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