Funktion neuartiger Enzyme der mikrobiellen Häm-Biosynthese

Zwerschke, Dagmar

Der Biosyntheseweg von Häm galt lange Zeit als hochkonserviert zwischen allen Reichen des Lebens. Jedoch zeigten Genomsequenzanalysen verschiedener Organismen, welche Häm bilden, dass bisher bekannte Gene der Häm-Biosynthese fehlten. Hierbei handelte es sich vor allem um Gene, welche für die Protoporphyrinogen IX Oxidase (PPO) und Coproporphyrinogen III Oxidase (CPO) codieren. Einer dieser Organismen mit ungewöhnlicher Häm-Biosynthese ist Leishmania spp.. Es weist einen verkürzten Biosyntheseweg auf, welcher nur aus den letzten drei Genen des Syntheseweges (CPO, PPO und FC) besteht. In der vorliegenden Arbeit konnte die Aktivität der PPO, welche zum HemG-Typ zählt experimentell nachgewiesen werden. Dies gelang zum einen in vivo über Komplementationsstudien mit einer delta hemG E. coli Mutante und zum anderen in vitro mit gereinigtem L. major HemG Protein. Des Weiteren konnte die Kopplung der PPO an die Atmungskette von E. coli aufgezeigt werden. Zudem wurde FMN als Kofaktor identifiziert. Basierend auf einem Strukturmodell sowie in vivo und in vitro Experimenten konnte für die Aminosäurereste Y134, Y137 und R142 eine Beteiligung an der Katalyse der durch die PPO katalysierten Reaktion gezeigt werden. Dabei war der Effekt für Y137 am stärksten ausgeprägt. Dies stellt die erste Charakterisierung einer PPO des HemG-Types in Eukaryoten dar. Zusätzlich hierzu wurde auch die potentielle CPO YtpQ aus B. subtilis untersucht. Es gelang YtpQ rekombinant zu produzieren und die CPO Aktivität erstmals zu beweisen. Zudem gelang es, das in dieser 2-stufigen Reaktion gebildete Intermediat Haderoporphyrinogen in seiner oxidierten Form Haderoporpyrin nachzuweisen. Ein möglicher Metallkofaktor, wie das vermutete Kobalt, konnte nicht identifiziert werden. Zusammengefasst, konnten in dieser Arbeit zwei neuartige Enzymtypen der Häm-Biosynthese erstmals identifiziert und charakterisiert werden.

The heme biosynthesis pathway was thought to be highly conserved throughout all domains of life. However, recent genome analysis of heme synthesizing bacteria showed a lack of known heme biosynthesis genes especially for the protoporphyrinogen IX oxidase (PPO) and coproporphyrinogen III oxidase (CPO). One of these organisms with an uncommon heme biosynthesis is Leishmania spp.. This organism has a shorten biosynthesis pathway consisting only of the last three enzymes (CPO, PPO, ferrochelatase (FC)). In the present study the activity of the HemG-type PPO could be experimentally demonstrated. Therefore, in vivo complementation studies with a delta hemG E. coli mutant as well as in vitro activity assays with purified L. major HemG were performed. Furthermore, the coupling of the PPO with the respiratory chain of E. coli could be shown. In addition, flavin mononucleotide was elucidated as Cofactor of the L. major PPO. Based on a protein structure model as well as in vivo and in vitro experiments the amino acid residues Y134, Y137, and R142 could be revealed as being involved in the PPO catalyzing reaction. Hereby, the effect for Y137 was the strongest. Thus, this study represents the first of a eukaryotic HemG-type PPO. Additionally, the potential CPO YtpQ of B. subtilis was analyzed. YtpQ was recombinantly produced and its CPO activity could be shown for the first time. Also, the intermediate of the 2-ary CPO reaction haderoporphyrinogen in its oxidized form haderoporphyrin were detected. A possible metal cofactor, like the assumed cobalt was not identified. Summarized, in this study two new enzyme types of the heme biosynthesis were identified and characterized for the first time.

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Zwerschke, Dagmar: Funktion neuartiger Enzyme der mikrobiellen Häm-Biosynthese. 2014.

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