Multiplex in vitro and in vivo RNAi screening to identify treatment response modifiers of targeted therapies in HCC

Rudalska, Ramona

Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) gilt als resistent gegen Chemotherapeutika, und erst durch die Entwicklung des Kinase-Inhibitors Sorafenib konnte eine systemische Behandlungsmethode gegen HCCs ermöglicht werden. Eine Monotherapie mit Sorafenib verbessert die durchschnittliche Überlebensrate von HCC Patienten aber nur um wenige Monate. Daher ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Sorafenib Behandlung zu verstehen, um potenzielle Kombinationstherapien mit besserer Wirkung zu entwickeln. Die Aktivierung des Ras/MAPK Signalwegs gilt als wichtig für die Entstehung und Entwicklung von HCCs. Durch die Nutzung eines mosaiken HCC Mausmodels, konnten NrasG12V getriebene Lebertumore in p19Arf-/- Mäusen erzeugt werden. Die Sorafenib Behandlung dieser Tumore zeigte einen geringen, aber signifikanten Behandlungseffekt, vergleichbar mit der Reaktion von humanen HCCs auf Sorafenib. Für die Identifizierung von Genen, die bei der Resistenzentwicklung der Sorafenib Behandlung eine Rolle spielen, wurde ein in vivo RNA-Interferenz Screening durchgeführt. Gepoolte shRNAs (gerichtet gegen amplifizierte Gene humaner HCCs) wurden zusammen mit NrasG12V in murinen, p19Arf-/- Tumoren exprimiert, welche mit Sorafenib oder einem Carrier behandelt wurden. Die Analyse der shRNA Verteilung in den Tumoren beider Gruppen zeigte mehrere shRNAs gegen Mapk14 (p38alpha) stark reduziert in Sorafenib behandelten HCCs, was auf eine Rolle von Mapk14 in der Sorafenib Resistenz hindeutet. Bei Validierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die shRNA vermittelte Reduktion von Mapk14 das Überleben Sorafenib behandelte Mäuse signifikant verlängert und die Proliferation von HCC Zellen verringert. Mittels regulierbaren shRNAs konnte zudem illustriert werden, dass das Ausschalten von Mapk14 die Sorafenib Behandlung auch in fortgeschrittenen HCCs verbessert. Auch pharmakologische Inhibitoren gegen Mapk14 steigerten den Effekt der Sorafenib Behandlung. Der Effekt dieser Kombinationstherapie konnte auch in HCC Zelllinien mit anderen genetischen Alterationen und in verschiedenen humanen HCC Zelllinien gezeigt werden. Der Transkriptionsfaktor Atf2 wurde zudem als wichtiger Mediator der Mapk14 vermittelten Resistenz gegen Sorafenib identifiziert. Die hier präsentierte Studie beschreibt eine Sorafenib basierte Kombinationstherapie für die Behandlung von HCCs und verdeutlich das Potenzial von in vivo RNA-Interferenz Screenings zur Identifizierung von Genen die Krebstherapien beeinflussen.

Hepatocellular carcinoma (HCC), represents a highly chemoresistant tumor and only recently the multikinase inhibitor Sorafenib was approved as the first active systemic treatment. However, Sorafenib monotherapy increases survival of HCC patients by less than three months, thus emphasizing the strong need to understand the mechanisms of Sorafenib sensitivity and resistance in order to inform new combination therapies with higher therapeutic efficacy. The Ras/MAPK signaling pathway is known to play a major role in HCC development and progression. The here presented mosaic liver cancer mouse model showed that Sorafenib treatment of oncogenic NrasG12V; p19Arf-/- driven murine HCCs results in moderate but distinct treatment responses, resembling the response rates of Sorafenib treated human HCCs. To identify genes mediating resistance or sensitivity towards Sorafenib, an in vivo RNAi screen was conducted. Pools of shRNAs targeting genes found amplified in human HCCs were applied and p19Arf-/- mice harboring NrasG12V expressing liver carcinomas with stable expression of shRNA library pools were either treated with Sorafenib or carrier. Subsequently, shRNA distribution was quantified in tumors from both cohorts using deep sequencing. Interestingly, independent shRNAs targeting Mapk14 (p38alpha) were found strongly depleted upon Sorafenib treatment, indicating a potential role of Mapk14 in Sorafenib resistance. Functional validation experiments show that Mapk14 knockdown can improve Sorafenib therapy and that this synergism is mainly due to a reduced proliferation of cancer cells. Using conditional RNAi technology, the sensitizing effect of Mapk14 knockdown towards Sorafenib treatments could also be shown in advanced tumors. Taking advantage of pharmacological Mapk14 inhibitors, it could be shown that combination therapy with Sorafenib results in a significant survival advantage of tumor bearing mice. Additionally, it was shown that the newly identified combination therapy is efficient in murine HCC cell lines with additional genetic backgrounds as well as in a panel of well-established human hepatoma cell lines. Furthermore, the transcription factor Atf2 was identified as relevant for Mapk14 mediated resistance. In summary, the here presented study establishes a new Sorafenib-based combination therapy for the treatment of HCC and highlights the potential of in vivo RNAi screens to identify genes that modulate the treatment response of cancer therapies.

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Rudalska, Ramona: Multiplex in vitro and in vivo RNAi screening to identify treatment response modifiers of targeted therapies in HCC. 2014.

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