Elucidating the mode of action of bioactive small molecules on the basis of High Content Analysis

Raja, Thadigiri Aruna Jyothi

Naturstoffe sind eine vorzügliche Quelle für Leitstrukturen, die ihre biologische Vielfalt einem breiten Spektrum an Wirkmechanismen verdanken, die aber oft schwierig aufzuklären sind. Diese Studie benutzte „High-Content“-Analysemethoden als Grundlage, um Hinweise auf den Wirkmechanismus ausgewählter Verbindungen zu bekommen. Diese Methoden umfassten zwei zell-basierte Ansätze; einer basierend auf automatischer Mikroskopie liefert Informationen in Form von Immunfluoreszenz-Bildern und der andere basierend dem xCELLigence-System Impedanzkurven als Ergebnis eines Echtzeit-Monitoring von Zellstörungen. Die Profile der individuellen Ansätze wurden mit denen von Referenz-Verbindungen verglichen, deren Wirkmechanismus bekannt und gut untersucht ist. Die zytotoxische Aktivität einiger ausgewählter bioaktiver Verbindungen, Jerantinine E, Paläo-Soraphen A und B und Disorazol A1 und Z, bei Krebszellen lag im mikro- bis subnanomolaren Bereich. Für das Indolalkaloid Jerantinine E konnte gezeigt werden, dass es die Tubulinpolymerisation stört. Paläo-Soraphen A und B, „genetische“ Derivate von Soraphen A, waren weniger aktiv als die Mutterverbindung und schienen verschiedene Wirkmechanismen zu haben. Während der Wirkmechanismus von Paläo-Soraphen A dem von Soraphen A glich, zeigte Paläo-Soraphen B Effekte, ähnlich denen des Topoisomerase-I-Hemmers Camptothecin. Am wirksamsten waren Disorazol (Dsz) A1 und Z, bekannt als Hemmer der Tubulin-Polymerisation. Die hier vorgestellten Untersuchungen deckten zusätzliche Zielproteine auf, die bei niedrigeren Konzentrationen adressiert werden. DARTS-Ansätze (drug affinity responsive target stability) zeigten, dass Dsz A1 an das Phosphatase-Enzym PTEN bindet, was zu einer Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs führt, während Dsz Z auf p85 abzielt, die regulatorische Einheit der PI3-Kinase. Western-Blot-Analysen zeigten, dass Dsz A1 und Z, obwohl strukturell ähnlich, verschiedene biologische Wirkungen haben. Dsz A1 beeinflusste den PI3K/Akt-Signalweg, während Dsz Z unabhängig von Akt den PI3K/SGK-Signalweg blockierte. Dsz Z induzierte eine Dephosphorylierung von p85. Knockdown-Studien mit den entsprechenden Zielproteinen bestätigten ihre Einbindung in die verschiedenen Signalwege. Eine Messung der Anreicherung von Oligonuclesomen bestätigte die maßgebende Rolle von PTEN in der Apoptose-Induktion durch Dsz A1. Caspase-Aktivitätsmesssungen in Knockdown-Zellen belegten die Rolle von p85 in der durch Dsz Z induzierten Apoptose.

Natural products are a prime source of “lead” compounds who owe their biological diversity to a broad spectrum of mechanisms which are often difficult to elucidate. This study applied high content analysis methods as the basis to get hints towards the mode of action (MoA) of a set of compounds of interest. These methods included two cell-based approaches, one based on automated microscopy which provides information in the form of immunofluorescence images and the other based on the xCELLigence system providing impedance curves as a result of a real-time monitoring of cell perturbations. Profiles from individual approaches were compared with those of reference compounds whose mechanisms were known and well established. The cytotoxic activity of few selected bioactive compounds, namely jerantinine E, paleo-soraphen A & B, and Dsz A1 and Z varied from micro- to subnanomolar ranges in cancer cells. Jerantinine E, an indole alkaloid, was shown to interfere with tubulin polymerisation. Paleo-soraphen A & B, genetic derivatives of soraphen A, were less active than their parent compound and seemed to have different mechanisms. Paleo-soraphen A showed a mechanism similar to that of soraphen A whereas paleo-soraphen B showed effects similar to the topoisomerase I inhibitor camptothecin. Most potent among all were disorazol (Dsz) A1 and Z which have been known as tubulin polymerisation inhibitors. Detailed investigations presented here revealed additional targets which were addressed at lower concentrations. Drug affinity responsive target stability (DARTS) approaches showed that Dsz A1 binds to the phosphatase enzyme PTEN which antagonizes the PI3K/Akt pathway whereas Dsz Z targets dephosphorylation of the regulatory unit of PI3 kinase, p85. Western blot analysis showed that Dsz A1 and Z, though structurally similar, have different biological implication. Dsz A1 affects the PI3K/Akt pathway whereas Dsz Z stalls the PI3K/SGK pathway, independent of Akt. Knockdown studies of the respective target proteins confirmed their involvement in the different pathways. Measuring oligonucleosome enrichment confirmed the decisive role of PTEN in apoptosis induction by Dsz A1. Caspase activity measurements in knockdown cells provided evidence of the role played by p85 in apoptosis induction by Dsz Z.

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Raja, Thadigiri Aruna Jyothi: Elucidating the mode of action of bioactive small molecules on the basis of High Content Analysis. 2014.

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