Characterisation of methionine metabolism of Pseudomonas aeruginosa under conditions resembling a chronic cystic fibrosis lung infection

Wesche-Franke, Andrea

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der Wachstumsbedingungen in den zystische Fibrose (CF) Luftwegen auf die infizierenden Pseudomonas aeruginosa Stämme untersucht. Eine globale Transkriptionsanalyse der P. aeruginosa Genexpression wurde sowohl unter simulierten Respirationstraktbedingungen in artifiziellem Sputum-Medium (ASM) als auch unter ex vivo CF Lungeninfektionsbedingungen durchgeführt. Dabei wurde Eisenmangel als der entscheidende Faktor in den CF Luftwegen in vivo identifiziert. Daraufhin wurde ASM-Chelex mit erhöhter Eisenlimitierung entwickelt. Zusammenfassend imitiert ASM-Chelex die in vivo Lungeninfektionsbedingungen präziser. Im zweiten Teil wurde die Methioninauxotrophie als Anpassungsstrategie von P. aeruginosa an die chronische CF Lungeninfektion untersucht. Insgesamt wurden 30 P. aeruginosa Stämme von 15 verschiedenen CF Patienten isoliert und durch Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) klassifiziert. Als genetische Ursache für die Methioninauxotrophie wurde das Gen metF der Kofaktorbiosynthese für die Mehrheit der untersuchten klinischen Isolate identifiziert. Das Gen metF kodiert für eine Methylentetrahydrofolat-Reduktase. Es wurde bewiesen, dass die Methioninauxotrophie unabhängig vom Mutatorphänotyp selektioniert wird. Die Produktion des bedeutenden Virulenzfaktors Pyocyanin war in allen methioninauxotrophen klinischen Isolaten, in PAO1 ∆metF und in verschiedenen Methioninstoffwechseldeletionsmutaten reduziert. Als Grund wurde der mögliche verringerte SAM-Spiegel diskutiert. Die Transkriptomanalyse von PAO1 ∆metF zeigte, dass eisenregulierte Gene stärker exprimiert wurden. Der Einfluss der Methioninauxotrophie auf die Eisenhomöostase und mögliche Eisenbeschaffungsvorteile für PAO1 ∆metF wurde diskutiert. Im dritten Teil wurde die antimikrobielle Aktivität von Ribavirin gegen P. aeruginosa PAO1 nachgewiesen. Die S-Adenosylhomocystein-Hydrolase SahH scheint nicht der Hauptangriffspunkt von Ribavirin in P. aeruginosa zu sein. Die Inhibition des Enzyms SahH durch Ribavirin war sehr gering. Es wurde jedoch gezeigt, dass das Enzym SahH ein essentieller Bestandteils des bakteriellen Stoffwechsels ist und sich daher besonders gut als Ziel für Antibiotika eignet. Diese Arbeit trägt zum Verständnis der zugrunde liegenden Anpassungsstrategien von P. aeruginosa während der CF Infektion bei und zeigt mögliche therapeutische Strategien auf.

The first part of this study investigated the influence of the growth conditions in the cystic fibrosis (CF) airways on the infecting Pseudomonas aeruginosa strains. A global transcriptional analysis of P. aeruginosa gene expression under simulated respiratory tract conditions in vitro in artificial sputum medium (ASM) and under ex vivo CF lung infection conditions was performed. Iron limitation was identified as the crucial factor in the CF airways in vivo. Therefore, ASM-Chelex with increased iron limitation was developed. In conclusion ASM-Chelex mimics in vivo lung infection conditions more precisely. In the second part methionine auxotrophy as adaptation strategy of P. aeruginosa towards the chronic CF lung infection was investigated. In total 30 P. aeruginosa strains isolated from 15 different CF patients were classified by single-nucleotide polymorphisms analysis (SNP). As genetic cause of methionine auxotrophy the gene metF of the cofactor biosynthesis was identified in the majority of investigated clinical isolates. The gene metF encodes for a methylenetetrahydrofolate reductase. It was verified that the methionine auxotrophy is selected independently of the mutator phenotype. Notably, the production of the major virulence factor pyocyanin was reduced in all methionine auxotrophic clinical isolates, in PAO1 ∆metF and several methionine metabolism deletion strains. The possible reduced intracellular SAM level was discussed as cause. A transcriptome analysis of PAO1 ∆metF showed upregulation of iron regulated genes. The influence of methionine auxotrophy on iron homeostasis and the possible advantage in iron acquisition of PAO1 ∆metF was discussed. In the third part the antimicrobial activity of ribavirin against P. aeruginosa PAO1 was verified. S-Adenosylhomocysteine hydrolase SahH seems not to be the main target of ribavirin in P. aeruginosa. The inhibition of the enzyme SahH by ribavirin was very low. However, it was shown that the enzyme SahH is an essential part of bacterial metabolism and therefore a powerful drug target candidate. In summary this thesis contributes to the understanding of the underlying adaptation strategies of P. aeruginosa during the CF infection and indicates possible therapeutic strategies.

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Wesche-Franke, Andrea: Characterisation of methionine metabolism of Pseudomonas aeruginosa under conditions resembling a chronic cystic fibrosis lung infection. 2014.

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