Affinitätsreifung von Antikörperfragmenten mittels Phagen-Display für die Entwicklung von therapeutischen IgGs

Steinwand, Miriam

Monoklonale Antikörper werden für die Therapie unterschiedlicher Krankheiten eingesetzt, darunter sind vor allem schwerwiegende Erkrankungen wie Krebs oder Autoimmunkrankheiten. Für diesen Zweck werden bisher vorwiegend IgGs verwendet. Die in vitro Affinitätsreifung findet dagegen hauptsächlich in den weniger komplexen Fragmenten der vollständiger Antikörper statt, da deren Expression durch prokaryotische Produktionswirte möglich ist. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass das Antikörperformat, das zur Phagen-Display basierten Affinitätsreifung eingesetzt wird, die Bindungsstärke der resultierenden IgGs beeinflusst. Die Konvertierung affinitätsgereifter Antikörper in das IgG-Format kann mit einem Affinitätsverlust einhergehen, so dass die konvertierten Antikörper keine erhöhte Affinität gegenüber dem ursprünglichen IgG haben. Diese Beobachtung wurde für den Antikörper SH313-F9 in den Formaten scFv und scFabdC gemacht, bei denen wahrscheinlich Mutationen bevorzugt werden, die nur durch die Präsenz des Petidlinkers zu erhöhten Affinitäten gegenüber dem Ausgangsantikörper führten. Im Gegensatz dazu behielten die im FabdC-Format gereiften Antikörper ihre verstärkte Antigenbindung auch im IgG-Format bei. Durch die Deletion der jeweils C-terminalen Cysteine des Fabs wurde die Präsentation funktioneller Antikörperfragmente auf der Oberfläche von Phagen im Vergleich zum Fab-Format verbessert. Darüber hinaus wurden in dem resultierenden FabdC-Fragment im Gegensatz zum Fab affinitätsgereifte Varianten selektiert. Aufbauend auf den affinitätgesteigerten Antikörpern wurden zwei Shuffling-Methoden angewandt, um die Affinitäten der IgGs weiter zu erhöhen. Während das Chain Shuffling nicht zu einer weiteren Steigerung der Affinitäten der IgGs führte, wurde dies und teilweise auch eine gesteigerte Temperaturstabilität durch das DNA-Shuffling mit anschließender Phagen-Display Selektion im FabdC-Format erreicht. Die dadurch erfolgreich generierten, affinitätsgereiften IgGs waren eine Bestätigung der Konvertierung affinitätsgereifter FabdC in IgGs ohne den Verlust von Affinität.

Monoclonal antibodies have become an important therapeutic tool for the treatment of various diseases, mostly cancer and autoimmune diseases. For this purpose nearly all antibodies are provided as IgGs. In vitro affinity maturation is mostly carried out in less complex fragments of full length antibodies, because they can be expressed by prokaryotic production hosts. In this study it was demonstrated that the antibody format used for phage display based affinity maturation influences the affinity of the corresponding IgG. The conversion of affinity matured antibody fragments into IgG can be accompanied with loss of affinity resulting in IgGs with decreased antigen binding compared to the parental clone. This behavior was shown for SH313-F9 scFv and scFabdC, possibly due to mutations, that led to enhanced affinities compared to the original antibody only in the presence of the peptide linker. In contrast, affinity matured FabdC retained their enhanced affinity as IgG. The deletion of c-terminal cysteines led to enhanced functional expression on the phage surface and allowed the generation of affinity matured antibodies compared to Fab. Based on the affinity matured antibodies, two shuffling methods were employed to further enhance the affinty of the IgGs. Chain shuffling of affinity matured antibody fragments converted to IgG did not lead to further enhancement of affinity. In contrast, IgGs generated by DNA shuffling had enhanced affinities and partially enhanced temperature stability compared to former affinity matured IgGs. The generation of affinity matured IgGs by DNA shuffling followed by FabdC based phage display selection was a confirmation for the conversion of affinity matured FabdC into IgG without loosing affinity.

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Steinwand, Miriam: Affinitätsreifung von Antikörperfragmenten mittels Phagen-Display für die Entwicklung von therapeutischen IgGs. 2014.

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