Identification and characterization of proteins involved in proper functioning of UNC93B-Toll-like receptor complexes

Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI)
Reimer, Elisa

Toll-like receptors (TLRs) are key players of the innate immune system. Localized at the cell surface or intracellularly, they trigger immune responses upon recognition of pathogenic patterns. After their synthesis in the endoplasmic reticulum (ER), intracellular TLRs 3, 7, and 9 need to move to the endolysosome to meet their ligands. On their way they are escorted by the polytopic membrane protein UNC93B. UNC93B interacts with TLRs 3, 7, and 9 and delivers them from the ER to the endolysosome where they initiate the expression of proinflammatory cytokines and type I interferon (IFN) upon encounter of nucleic acids. In 3d mice, which express a missense mutant of UNC93B (H412R), binding of UNC93B to TLRs is disrupted and UNC93B H412R as well as intracellular TLRs fail to leave the ER. How function and trafficking of UNC93B-TLR complexes is regulated is not entirely understood. A comparison of innate immune cells derived from UNC93B knockout and 3d mice showed that the phenotype of cells from UNC93B knockout mice does not differ from the 3d phenotype. In a proteomics approach, cleft lip and palate transmembrane protein (Clptm), three prime repair exonuclease 1 (Trex1), and the protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) have been identified as novel binding partners of UNC93B in macrophages. Co-immunoprecipitation experiments verified interactions between UNC93B, the previously uncharacterized protein Clptm, as well as the negative regulator of cytosolic DNA responses Trex1. PTP1B is known to be crucial for intracellular trafficking of receptor tyrosine kinases, but had not been linked to regulation of TLR signaling. Interaction of PTP1B with UNC93B, Clptm, TLR7, and TLR9 was verified by co-immunoprecipitation. The TLR-independent type I IFN response upon infection of bone marrow-derived macrophages with mouse cytomegalovirus, as well as the TLR7- and TLR9-dependent IFNalpha responses in plasmacytoid dendritic cells (pDC) were impaired in cells derived from PTP1B knockout mice compared to wild type cells. Furthermore, PTP1B knockout mice showed significantly reduced IFNalpha and interleukin (IL)-12p40 responses compared to wildtype mice upon stimulation of TLR9 by intravenous administration of CpG oligonucleotides in vivo. This suggests that PTP1B is a critical regulator of the TLR7- and TLR9-dependent IFNalpha response in pDC as well as the TLR-independent type I IFN response in macrophages.

Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Sie werden an der Zelloberfläche oder intrazellulär exprimiert und lösen bei der Erkennung pathogener Strukturen Immunantworten aus. Nach ihrer Synthese im endoplasmatischen Retikulum müssen die intrazellulären TLRs 3, 7 und 9 ins Endolysosom gelangen, um auf ihre Liganden zu treffen. Das Membranprotein UNC93B interagiert mit den TLRs 3, 7 und 9 und eskortiert sie vom ER zum Endolysosom, wo sie die Expression von proinflammatorischen Zytokinen und Typ I Interferon (IFN) initiieren, wenn sie auf Nukleinsäuren treffen. In 3d Mäusen, die UNC93B mit einer missense-Mutation (H412R) exprimieren, kann UNC93B nicht an die TLRs binden, weshalb UNC93B H412R und intrazelluläre TLRs das ER nicht verlassen können. Wie die Funktion und der Transport von UNC93B-TLR-Komplexen reguliert werden, ist nicht vollständig geklärt. Ein Vergleich von Immunzellen, die aus UNC93B knockout oder 3d Mäusen generiert wurden, zeigte, dass der Phänotyp der UNC93B knockout Zellen sich nicht vom 3d Phänotyp unterscheidet. Cleft lip and palate transmembrane protein (Clptm), three prime repair exonuclease 1 (Trex1) und protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) wurden mittels eines Proteomik-Ansatzes als neue Bindungspartner von UNC93B identifiziert. Die Interaktion zwischen UNC93B und dem uncharakterisierten Protein Clptm sowie Trex1, einem negativen Regulator der Immunantwort auf zytosolische DNA, wurde mittels Ko-Immunpräzipitation bestätigt. PTP1B ist wichtig für den intrazellulären Transport von Rezeptor-Tyrosinkinasen, wurde aber bisher nicht mit der Regulation von TLRs in Verbindung gebracht. Interaktionen zwischen PTP1B und UNC93B, Clptm, TLR7 und TLR9 wurden mittels Ko-Immunpräzipitation bestätigt. Die TLR-unabhängige Typ I IFN-Antwort nach der Infektion von Makrophagen, die aus PTP1B knockout Mäusen generiert wurden, mit Maus-Cytomegalievirus sowie die TLR7- und TLR9-abhängige IFNalpha-Antwort von plasmazytoiden dendritischen Zellen von PTP1B knockout Mäusen waren im Vergleich zu Wildtyp-Zellen vermindert. Außerdem waren die IFNalpha-Antwort und die Interleukin (IL)-12p40-Antwort nach intravenöser Verabreichung von CpG Oligonukleotiden in vivo in PTP1B knockout Mäusen im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PTP1B ein entscheidender Regulator der TLR7- und TLR9-abhängigen IFNalpha-Antwort in pDC sowie der TLR-unabhängigen Typ I IFN-Antwort in Makrophagen ist.


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