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Untersuchungen zum Aktivierungsmechanismus der NO-sensitiven Guanylat-Cyclase und zu ihrer subzellulären Lokalisation

GND
1055018565
Zugehörigkeit/Institut
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Klinische Pharmazie
Busker, Mareike Irene

Der NO / cGMP-Signalweg spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des Blutdrucks und der Relaxation der glatten Muskulatur und bei der Thrombozytenaggregation. Das zentrale Enzym dieses Signalwegs ist die Stickstoffmonoxid-sensitive Guanylat-Cyclase (NOsGC). Gegenstand der Arbeit war die Untersuchung der dynamischen Konformationsänderungen der NOsGC bei NO-Stimulation unter Verwendung der endogenen Tryptophane als FRET-Donatoren und dem Substratanalogon 2´-Mant-3´-dGTP als FRET-Akzeptor. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass das NO-Aktivierungssignal von der HNOX-Domäne über zwei unterschiedliche Domänen auf die katalytische Domäne übertragen wird. Die Bewegung von Helices aus diesen beiden Domänen in Richtung der katalytischen Domäne führen dazu, dass sich diese schließt und in ihre aktive Konformation übergeht. Das Polaritätsprotein Scribble wurde im Rahmen dieser Arbeit als möglicher Interaktionspartner der α2-Untereinheit identifiziert. Untersuchungen der Lokalisation der α2 / β1 Isoform an Zell-Zell-Kontakten ergaben, dass nur das Heterodimer aus α2- und β1-Untereinheit die besondere Lokalisation zeigt, während die einzelne α2 Untereinheit zytosolisch verteilt ist. Zur Untersuchung der intrazelluläre und lokalisationsbezogene Aktivität der NOsGC wurden auf Basis des cGMP-Fluoreszenzindikators FlincG und den beiden Isoformen der NOsGC zwei monomolekulare Fluoreszenzsensoren charakterisiert. Der Einsatz der Fluoreszenzsensoren ergab, dass die besondere Lokalisation der α2 / β1-Isoform an Zell-Zell-Kontakten dem Abfangen von NO an der Membran dienen könnte und dass der NOsGC-Aktivator Cinaciguat einen schnellen Anstieg der intrazellulären NOsGC-Aktivität verursacht. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit das Verständnis der Signaltransduktion der NO-Aktivierung innerhalb der NOsGC erweitert werden. Zusätzlich konnten Einblicke in den Wirkmechanismus neuer Arzneistoffgruppen gewonnen werden, deren Zielstruktur die NOsGC ist.

The NO / cGMP pathway plays a crucial role in the regulation of blood pressure and smooth muscle relaxation, platelet aggregation and in the central and peripheral neurotransmission. The key enzyme of this pathway is the nitric oxide-sensitive guanylate cyclase (NOsGC). In this study the dynamic conformational changes to NOsGC upon NO stimulation were examined through the use of the endogenous tryptophan residues of NOsGC as FRET donors and the substrate analogue 2'-Mant-3'- dGTP as a FRET acceptor. The results indicate that the activation signal from the amino terminal heme and NO binding domain (HNOX) is transmitted via two different domains to the carboxy terminal catalytic domain. After NO stimulation the movement of two helices from this domains leads to a closure of the catalytic domain and induces its active conformation. The regulator of cell polarity, scribble, was identified as an interaction partner of α2 / β1 isoform. Investigation of the localization of this isoform at cell-cell contacts revealed that only the heterodimer of α2 and β1 subunit is located at cell-cell contacts. To investigate the intracellular localization and activity of NOsGC two monomolecular fluorescent sensors based on the cGMP fluorescence indicator FlincG and the two NOsGC isoforms (α1 / β1 and α2 / β1) were developed and established. The use of the fluorescence sensors led to the observation that the special localization of the α2 / β1 isoform at cell-cell contacts serves to intercept NO on the membrane and reveal that the NOsGC activator cinaciguat causes a rapid increase in intracellular NOsGC activity. In summary, this study furthers the understanding of NO-signal transduction within the intact full-length NOsGC. In addition, experiments give insight into the activation mechanism of new NOsGC activator and stimulator drugs.

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