Human recombinant antibodies against Mycobacterium tuberculosis antigens

Fuchs, Manon

Tuberkulose (TB) ist immer noch eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit. Die Diagnose von TB ist häufig teuer oder zeitaufwendig. Der Gebrauch von rekombinanten Antikörpern (AK) zur direkten Detektion von M. tuberculosis (Mtb) Antigenen in humanen Proben könnte einen simplen TB Schnelltest ermöglichen. Eine mannigfaltige Serie von Antigenen wurde für diesen Zweck untersucht, einschließlich 16 kDa, ESAT-6, CFP-10, LAM, AlaDH, 85 A, 85 B und 85 D. Zweiundzwanzig rekombinante AK gegen 16 kDa, CFP-10, 85 A, 85 B und 85 D wurden mittels Panning von humanen naïven Phagendisplaybibliotheken generiert. Ein rekombinanter a-LAM AK wurde generiert durch Isolierung der variablen Gensegmente der IgM kodierenden Sequenzen eines Hybridoms. Diese AK wurden als scFv aus E. coli oder als scFv-Fc (scFab-Fc) aus HEK293-6E Zellen aufgereinigt und detailliert charakterisiert. Der a-LAM AK war nur als multivalenter scFab-Fc produzierbar. Sieben AK zeigten eine bevorzugte Genkombination gegen das 16 kDa Antigen. Ein Sandwichnachweis von 16 kDa und CFP-10 war nicht möglich. Spezifische AK gegen 85 A, 85 B und 85 D konnten isoliert werden, die erstmals eine Unterscheidung individueller Komponenten des 85 Komplexes ermöglichen. Weiterhin war der Sandwichnachweis von rekombinantem 85 A oder 85 B möglich, wobei eine multimere Antigenkonformation die Erkennung verbesserte. Das Fehlen von Multimeren reduzierte die Bindung auf ein Minimum. Ein Sandwichnachweis von Mtb Proben war nicht möglich, jedoch konnte ein funktionaler a-85 B Immunoblottest entwickelt werden. Insgesamt wurden eine Vielzahl von AK generiert mit Potential für die weitere Entwicklung eines TB Schnelltests, für die Verwendung in der Infektionsforschung, für die Medikamentenentwicklung oder zur passiven Immunisierung.

Tuberculosis (TB) remains a threat to public health. Diagnostic of TB is often expensive or time-consuming. The use of recombinant antibodies for direct detection of M. tuberculosis (Mtb) antigens in human specimens could facilitate a simple point of care TB test. A diverse series of antigens was evaluated for this task, including 16 kDa, ESAT-6, CFP-10, LAM, AlaDH, 85 A, 85 B and 85 D. Twenty-two recombinant antibodies against 16 kDa, CFP-10, 85 A, 85 B and 85 D were generated by panning of human naïve phage display libraries. A recombinant a-LAM antibody was generated by isolation of the variable gene segments of the IgM encoding sequences from a hybridoma clone. These antibodies were purified as scFv from E. coli or scFv-Fc (scFab-Fc) from HEK293-6E cells, and characterized in detail. It was found, that the a-LAM antibody was only producible in a multivalent scFab-Fc format. Seven antibodies showed a supposed preferential germline gene combination against the 16 kDa antigen. Sandwich detection of 16 kDa and CFP-10 was not possible. Specific antibodies against 85 A, 85 B and 85 D were isolated, allowing for the first time discrimination of individual components of the 85 complex. Furthermore, sandwich detection of recombinant antigen 85 A or 85 B was possible. However multimeric conformation of the antigen was enhancing the recognition. Lack of multimers reduced binding to a minimum. Although no sandwich detection of Mtb samples was possible, a functional a-85 B immuno blot assay was developed. In summary, a variety of antibodies was generated with potential for further development of a TB diagnostic assay or for use in infection research, drug development or passive immunization.

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Fuchs, Manon: Human recombinant antibodies against Mycobacterium tuberculosis antigens. 2014.

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