Identification and expression analysis of small regulatory RNAs in Yersinia pseudotuberculosis

Waldmann, Barbara Ellen

Die Bedeutung von kleinen regulatorischen RNAs (small RNAs = sRNAs) für die Regulation komplexer bakterieller Netzwerke wurde in den letzten Jahren deutlich. Diese Studie hat sich mit der Identifizierung neuer sRNAs in dem humanpathogenen Bakterium Yersinia pseudotuberculosis beschäftigt. Mit Hilfe von 454 Pyrosequenzierung und Illumina Sequenzierung konnten 109 neue trans-kodierte und 98 neue cis-kodierte antisense sRNAs identifiziert werden. Die Expression von 47 putativen sRNAs wurde experimentell validiert und deren temperatur- oder wachstumsphasenabhängige Expression bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von etwa 50 % dieser sRNAs von dem RNA Chaperon Hfq abhängig ist. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Detektion von sRNAs sowohl von den verwendeten Wachstumsbedingungen, als auch von dem gewählten Stamm, der verwendeten Detektionsmethode und den bioinformatischen Kriterien abhängt. Interessanterweise konnte während dieser Arbeit Crp als globaler Regulator der sRNA Expression identifiziert werden. 91 der neu identifizierten sRNAs wurden direkt oder indirekt von Crp beeinflusst. Die Crp abhängige Expression wurde mittels northern blot Analysen für 13 Kandidaten bestätigt. Crp bindet direkt an die Promotorregion von fünf Kandidaten. Die durch die Illumina Sequenzierung generierten Daten erlaubten auch eine globale Analyse der Genexpression in Abhängigkeit von der Temperatur, der Wachstumsphase und von dem Crp Protein. Zusätzlich wurden die Ausgangspunkte der Transkription vieler Gene identifiziert. Die Funktion vieler sRNAs ist abhängig von dem RNA Chaperon Hfq. Diese Studie hat sich auch mit der Regulation der hfq Genexpression beschäftigt. Im Gegensatz zu E. coli wird die Expression von hfq nicht durch die Proteine CsrA und Crp reguliert. Für die Adaptation an oxidativen Stress ist Hfq jedoch relevant. Dieses Stresssignal führte zu reduzierten intrazellulären Hfq Proteinmengen.

In the last years it has been realized that bacterial small non-coding RNAs (sRNAs) serve as important components of diverse regulatory circuits. In this study, 109 novel trans-encoded sRNAs and 98 novel cis-encoded antisense sRNAs were identified in the human pathogen Yersinia pseudotuberculosis YPIII. The expression of 47 candidate sRNAs was validated experimentally and proved that most of these sRNAs were expressed in a temperature- and/or growth phase-dependent manner. Further, 50 % of the experimentally validated sRNAs showed a dependence on the RNA chaperone Hfq. A comparison to other studies identifying sRNAs in Yersinia species showed only a partial overlap. The study reported here proved, that this is due to strain specific sRNA expression. Additionally, the growth medium as well as technical and bioinformatic differences influenced the identification. Interestingly, this study showed that in Y. pseudotuberculosis Crp is not only an important regulator controlling virulence and metabolism but is also important for sRNA expression. 91 of the newly identified sRNAs were either directly or indirectly dependent on Crp. The expression pattern of 13 candidates was analyzed by northern blotting. Additionally, a direct interaction of Crp with the upstream region of five of these candidates could be proven. Illumina sequencing allowed both the identification of novel sRNAs and monitoring the gene expression on a global scale comparing different temperatures, growth phase and the influence of Crp. Additionally, transcriptional start sites were mapped on a global level. The expression and function of sRNAs is mainly dependent on the RNA chaperone Hfq. Here, the regulation of hfq gene expression was investigated. In contrast to E. coli hfq expression was not dependent on CsrA or Crp. Furthermore, it could be shown that Hfq is required for resistance to oxidative stress, whereby the stress signal itself was found to influence Hfq protein levels.

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Waldmann, Barbara Ellen: Identification and expression analysis of small regulatory RNAs in Yersinia pseudotuberculosis. 2014.

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