Infectious Prion Strain Directed Conformational Conversion of Recombinant PrP

Gupta, Vandana

Prionen entstehen durch die Konversion des normalen, alpha-helikalen, zellulären Prion-Proteins (PrPC), in ein infektiöses, beta-Faltblatt-reiches Konformer (PrPSc). Dieser Modell wird auch als „Protein-Only-Hypothese” bezeichnet, die davon ausgeht, dass ein einziges Protein für eine grosse Vielfalt an Strukturen mit unterschiedlichen pathogenen Eigenschaften verantwortlich ist. Für Jahrzehnte hat diese Hypothese Wissenschafter motiviert, die Eigenschaften dieses neuen Pathogens zu entschlüsseln. Trotzdem gibt es immer noch viele unverstandene Eigenschaften der Prionen, und ihre molekulare Struktur ist noch immer unbekannt. Für eine Strukturbestimmung von Prionen mittels NMR-Spektroskopie werden sehr grosse Mengen an isotopenmarkierten, rekombinanten Prionen benötigt. Zu diesem Zweck wurde in unserer Gruppe eine neuartige Methode entwickelt, genannt “Selective Shearing Amplification” (SSA), die gleichförmige Scherkräfte nutzt, um Prionenwachstum und -fragmentierung optimal zu balancieren. Das Hauptziel in dieser Arbeit war es, SSA für die Selektion und homogene Amplifikation von Prionkonformatioen zu etablieren. Dabei sollten die Hamster-Prionstämme 263K und Sc237 aus Hamstergehirnen als ‘Seed’ und natives, rekombinantes Prion-Protein als Substrat verwendet werden. Insgesamt wurden 800 mg unmarkiertes und isotopenmarkiertes (15N und 13C/15N) rekombinantes Sc237 und 263K PrPres mit SSA hergestellt. Diese Produkte wurden dann weiter mit SSA, Elektronenmikroskopie, Massenspektrometrie und Festkörper-NMR charakterisiert. Letzteres zeigte drei spezifische Prion-Konformationen in Sc237, aber nur eine in 263K. Es ist herauszustellen, dass letztere Konformation auch als Teil der konformationellen Mischung in Sc237 vorhanden ist. Experimentell wurden die Konformationen also nicht durch die Scherkräfte induziert, sondern sie können vielmehr aus Mischungen selektiert werden. Damit wird es aufgrund dieser Arbeit möglich sein, die 3D-Strukturen von Prionen zu bestimmen.

Prions are derived from the conversion of a normal, alpha-helical, cellular prion protein (PrPC), to an infectious, beta-sheet rich conformer (PrPSc). This proposition was referred as the protein-only hypothesis where the single protein is responsible for a wide diversity of structures with different pathogenic properties. For decades this hypothesis has motivated the scientific community to decipher the elusive features of this new pathogen. However, many unresolved issues still surround the process of PrP conversion, and the molecular structure of PrPSc is still missing. For structural elucidation of prions by NMR-Spectroscopy, the prerequisite is to obtain extensive amounts of isotope labeled recombinant prions. For this, a novel method had been established in our group called “Selective Shearing Amplification” (SSA), where uniform shear forces were used to optimally balance prion growth and prion fragmentation. It was the key objective of this work to establish SSA for the conformational selection and homogeneous amplification of prion conformations using hamster brain derived prion strains (263K and Sc237) as a seed and native recombinant prion protein as a substrate. A total of 800 mg of unlabelled and isotopically labelled (15N and 13C/15N) recombinant hamster Sc237 and 263K PrP aggregates were produced by SSA. These products were further characterized by SSA, negative stain electron microscopy, mass spectrometry and solid state NMR spectroscopy (ssNMR). Using ssNMR, we characterized conformationally selected rec. PrPres and identified three distinct prion conformations in Sc237, but only one conformation in 263K. Notably the 263K conformation is also present in the Sc237 prion conformational mixture. This indicated that overall seed conformations are not altered by shearing mechanisms, but rather conformation can be selected even from mixed aggregates. Thus, from this work it is evident that a structure determination of prions will be possible.

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Gupta, Vandana: Infectious Prion Strain Directed Conformational Conversion of Recombinant PrP. 2013.

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