cDNA Klonierung, Mutagenese und Lokalisation der Isobutyrophenon-Synthase aus Hypericum perforatum

Belhadj Ep Haddad, Ines

Das Tüpfel-Johanniskraut ist seit der Antike eine bekannte Heilpflanze mit vielfältigen pharmakologischen Eigenschaften. Seine Extrakte sind heute fester Bestandteil der Behandlung leichter bis mittelschwerer Depressionen. An ihrer Wirkung ist das Phoroglucin-Derivat Hyperforin als Wiederaufnahme-Hemmer von Neurotransmittern beteiligt. Das Grundgerüst des Hyperforins wird von einer Typ III Polyketid-Synthase (PKS III), der Isobutyrophenon-Synthase (BUS) gebildet. Sie kondensiert Isobutyryl-CoA als Startersubstrat mit drei Molekülen Malonyl-CoA. Aus Blüten von H. perforatum wurde poly(A+)-RNA isoliert und die cDNA für BUS (HpBUS) kloniert. Dieses Enzym wurde in E. coli als His6-tag-Protein heterolog exprimiert und charakterisiert. Es hatte 100% Aktivität mit Isobutyryl-CoA und ca. 95% relative Aktivität mit Benzoyl-CoA. Verschiedene BPS-Enzyme sind aus der Hypericum-Gattung kloniert und heterolog exprimiert worden. Der Vergleich der klonierten HpBUS mit diesen BPS ergab Unterschiede in nur wenigen Aminosäuren. Eine Reihe von Punkt-, Doppel- und Tripel-Mutationen wurden eingeführt und die Substrat- und Produktspezifitäten ausgewiesen. Die HpBUS-I68V- und die HpBUS-I176V/T277P-Mutante ergaben eine Valerophenon Synthase, die als Startersubstrat Isovaleryl-CoA bevorzugte. Die zwei Doppel-Mutanten T68I/T277P und T68I/I176V ergaben jeweils eine BUS. Aber sie unterschieden sich vom Wild-Typ in der Substratspezifität. Durch eine Tripelmutation (T68I/I176V/T277P) konnte die HpBUS in eine BPS, die die höchste Aktivität mit Benzoyl-CoA hatte wie die natürlichen BPS, überführt werden. Die HpBUS-T135L-Mutante war inaktiv. H. perforatum-Blätter besitzen helle schizogene Drüsen und schwarze Zellaggregate. Mit Hilfe der in situ Hybridisierung (ISH) konnte eine Lokalisierung von HpBUS-Transkripten in den hellen Drüsen von H. perforatum-Sprosskulturen erzielt werden. Aus Knospen und Zellkulturen von H. calycinum wurden zwei ORF kloniert und in E. coli exprimiert. Beide rekombinanten Enzyme waren inaktiv. In Zellkulturen von H. perforatum subsp. angustifolium wurden zwei PKS-Aktivitäten detektiert. Die Inkubationen von zellfreien Extrakten mit den Starter-Substraten Isobutyryl-CoA, Benzoyl-CoA und p-Cumaroyl-CoA in Gegenwart des Malonyl-CoA führten zur Bildung von Phlorisobutyrophenon und Phlorbenzophenon, aber nicht zur Bildung von Naringenin.

Das Tüpfel-Johanniskraut ist seit der Antike eine bekannte Heilpflanze mit vielfältigen pharmakologischen Eigenschaften. Seine Extrakte sind heute fester Bestandteil der Behandlung leichter bis mittelschwerer Depressionen. An ihrer Wirkung ist das Phoroglucin-Derivat Hyperforin als Wiederaufnahme-Hemmer von Neurotransmittern beteiligt. Das Grundgerüst des Hyperforins wird von einer Typ III Polyketid-Synthase (PKS III), der Isobutyrophenon-Synthase (BUS) gebildet. Sie kondensiert Isobutyryl-CoA als Startersubstrat mit drei Molekülen Malonyl-CoA. Aus Blüten von H. perforatum wurde poly(A+)-RNA isoliert und die cDNA für BUS (HpBUS) kloniert. Dieses Enzym wurde in E. coli als His6-tag-Protein heterolog exprimiert und charakterisiert. Es hatte 100% Aktivität mit Isobutyryl-CoA und ca. 95% relative Aktivität mit Benzoyl-CoA. Verschiedene BPS-Enzyme sind aus der Hypericum-Gattung kloniert und heterolog exprimiert worden. Der Vergleich der klonierten HpBUS mit diesen BPS ergab Unterschiede in nur wenigen Aminosäuren. Eine Reihe von Punkt-, Doppel- und Tripel-Mutationen wurden eingeführt und die Substrat- und Produktspezifitäten ausgewiesen. Die HpBUS-I68V- und die HpBUS-I176V/T277P-Mutante ergaben eine Valerophenon Synthase, die als Startersubstrat Isovaleryl-CoA bevorzugte. Die zwei Doppel-Mutanten T68I/T277P und T68I/I176V ergaben jeweils eine BUS. Aber sie unterschieden sich vom Wild-Typ in der Substratspezifität. Durch eine Tripelmutation (T68I/I176V/T277P) konnte die HpBUS in eine BPS, die die höchste Aktivität mit Benzoyl-CoA hatte wie die natürlichen BPS, überführt werden. Die HpBUS-T135L-Mutante war inaktiv. H. perforatum-Blätter besitzen helle schizogene Drüsen und schwarze Zellaggregate. Mit Hilfe der in situ Hybridisierung (ISH) konnte eine Lokalisierung von HpBUS-Transkripten in den hellen Drüsen von H. perforatum-Sprosskulturen erzielt werden. Aus Knospen und Zellkulturen von H. calycinum wurden zwei ORF kloniert und in E. coli exprimiert. Beide rekombinanten Enzyme waren inaktiv. In Zellkulturen von H. perforatum subsp. angustifolium wurden zwei PKS-Aktivitäten detektiert. Die Inkubationen von zellfreien Extrakten mit den Starter-Substraten Isobutyryl-CoA, Benzoyl-CoA und p-Cumaroyl-CoA in Gegenwart des Malonyl-CoA führten zur Bildung von Phlorisobutyrophenon und Phlorbenzophenon, aber nicht zur Bildung von Naringenin.

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Belhadj Ep Haddad, Ines: cDNA Klonierung, Mutagenese und Lokalisation der Isobutyrophenon-Synthase aus Hypericum perforatum. 2013.

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