Bildverarbeitung in der biomedizinisch eingesetzten Mikroskopie

Matz, Magnus Karl-Heinz

In der letzten Dekade hat sich die Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Standardmethode für die Beobachtung intrazellulärer, membrannaher Vorgänge entwickelt. Die erhaltenen Bilder und Videos werden normalerweise mit kommerzieller Software ausgewertet, mit der die Granula gezählt und auch über den Versuchsverlauf verfolgt werden können. In dieser Arbeit wird eine neu entwickelte Methode für die Auswertung von TIRF Videos im Rahmen der Insulinsekretionsforschung vorgestellt. Mit dieser können die Insulingranula ebenfalls identifiziert und verfolgt werden, zusätzlich ist es jedoch möglich, die Insulingranula nach ihren Eingeschaften wie Größe, Geschwindigkeit und Bewegungsverhalten zu unterscheiden. Ebenso können Exozytosevorgänge ausgewertet werden. Zur Vorbereitung der Auswertung wird zunächst eine Hintergrundsubtraktion durchgeführt. Anschließend wird das Rauschen mit Hilfe einer 3D-Faltungsoperation reduziert. Im weiteren Verlauf werden die Insulingranula identifiziert und über den Versuchsverlauf verfolgt. Die folgende Exozytosedetektion ist in der Lage, die auftretenden Intensitätsveränderungen während der Membranfusion und Insulinsekretion zu detektieren. Im Vergleich zu den in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen zur Objektidentifizierung und –verfolgung bietet die hier beschriebene Methode den Vorteil, auf die Vorgänge innerhalb der Zelle abgestimmt zu sein. Das Ziel ist es, die Bewegungen der Granula direkt in Diffusion und gerichtete Bewegung zu unterteilen. Zusätzlich zu dieser Bewegungsauswertung wird in dieser Arbeit eine neue Methode zur Exozytosedetektion vorgestellt. Die bisherige Vorgehensweise mit dem Einsatz von Kantenfiltern führt sehr oft zu falsch-positiven, aber auch falsch-negativen Ergebnissen. Mit der hier eingesetzten Variante des Clusterings werden bereits leichte Intensitätsanstiege innerhalb der Videosequenzen selektiv detektiert, welche mit den Vorgängen während der Insulinsekretion direkt in Verbindung stehen.

In the last decade, total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M) was established as a standard method for observing molecular phenomena close to the cell membrane. It is used here to study the behavior of insulin granules. The obtained TIRF images and video sequences are usually evaluated with commercial software packages, which allow counting of the labeled cell components and tracking of single labeled particles (i.e. insulin granules). Here we present a new and sophisticated program for the exploration of TIRF video sequences, enabling the user to simultaneously count and track all visible labeled objects. Moreover, the tracked objects can be characterized with respect to velocity, size, kinetic behavior, and exocytosis. The program starts with background subtraction. Next, a 3D convolution is carried out for noise reduction. Afterwards all fluorescing objects are tracked down and are being followed. A specifically tailored clustering routine in combination with an edge filter, which detects jumps, is used for exocytosis detection. Although methods for object identification and single particle tracking are well established in the literature, this work presents detection and tracking methods for the specific challanges and tasks in the given image sequences. The goal is to estimate whether a particular object moves due to diffusion or some kind of directed movement. A detailed analysis of the detection of exocytotic events is also presented. Simply using an edge filter on the tracks yields too many false positive and false negative events. The clustering routine employed here, is able to identify even small increases in fluorescence intensity, which are related to membrane fusion and the release of vesicle content.

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Matz, Magnus Karl-Heinz: Bildverarbeitung in der biomedizinisch eingesetzten Mikroskopie. 2013.

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