Structural Analysis of Nucleation Mechanism in Curli Biogenesis using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Nagaraj, Madhu

Amyloidfibrillen sind hochgeordnete Aggregate und in viele neurodegenerative Erkrankungen involviert. Anders als krankheitsrelevante Amyloide haben funktionale Amyloide, bekannt aus Bakterien, Pilzen, Insekten und auch vom Menschen, eine nützliche Funktion in vivo als natives Protein. Curli, extrazelluläre Proteinfibrillen von Escherichia coli, hilfen bei der Besiedlung inerter Oberflächen und vermittelt auch die Bindung an Wirtsproteine. Das Studium von Curli liefert eine einzigartige Grundlage im Verständnis der Amyloidpropagation. In vivo hängt die Curlibiogenese vom Nukleationsprotein CsgB ab, wobei die bis jetzt nur ansatzweise verstandene Nukleation der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist. Diese Arbeit beinhaltet eine strukturelle Analyse der Nukleation von Curli durch NMR. CsgB-wt Fibrillen wurden durch Wasserstoff/Deuterium Austausch NMR untersucht um ihre Sekundärstruktur zu bestimmen. Die Struktur von CsgB zeigt ein repetitives Muster aus vier Sequenzwiederholungen, jede formt ein Strang-Schleife-Strang Motiv, welches Teil des Amyloidkerns ist. Der N-terminale Abschnitt zeigt einen zusätzlichen beta-Strang und die C-terminale Region zeigt stark heterogenes Verhalten, welches durch partiellen Einbau des Bereiches in den Amyloidkern entsteht. Die Verkürzung des N- und C-Terminus von CsgB und anschließende Analyse der Nukleationseigenschaften zeigte, dass der N-Terminus von CsgB eine sequenzselektive Kontaktfläche für das Seeding von CsgA darstellt. Diese Studie zeigt auch, dass der N-Terminus von CsgB ein gerichtetes Fibrillenwachstum während der Curlibiogenese vorgibt. Der C-Terminus hingegen unterstürzt die Selbstfaltung von CsgB, welche als geschwindigkeitsbestimmender Schritt während der Nukleation von CsgA identifiziert werden konnte. Diese Ergebnisse präsentieren die ersten sequenzspezifischen Daten struktureller Elemente von CsgB-Fibrillen und liefern ein genaueres Bild des Nukleationsprozesses der Curlibiogenese auf struktureller Ebene.

Amyloid fibrils are highly ordered aggregates implicated in many neurodegenerative diseases. Unlike disease related amyloids, functional amyloids found in bacteria, fungi, insects and humans perform beneficial functions in vivo as native proteins. Curli an extracellular proteinaceous fibrils in Escherichia coli, helps in colonizing inert surfaces and mediate binding to host proteins. The study on curli provides a unique template for understanding controlled amyloid propagation. In vivo, amyloidogenesis is dependent on minor nucleator protein CsgB, hence nucleation form the rate-limiting step yet its nature remains poorly understood. The study comprised of structural analysis of nucleation mechanism in curli biogenesis using NMR. CsgB-wt fibers were analyzed by hydrogen/deuterium exchange NMR to determine sequence specific secondary structure. Studies on nucleation properties of CsgB truncation mutants were also conducted. The structure of CsgB revealed a repetitive structural pattern with 4 repeat sequences each forming strand-turn-strand motif in the amyloid core. The N-terminal region showed an additional single beta-strand and the C-terminal region displayed highly heterogeneous behaviour indicating its partial incorporation in the amyloid core. Mutational studies by truncation of both the N and C terminal region of CsgB followed by analysis on its nucleation property with CsgA revealed that the N- terminus of CsgB was involved in sequence selective interface for seeding CsgA. The aforementioned study also indicated that the N- terminus of CsgB was involved in providing directionality of fiber growth during curli biogenesis. The C-terminus was involved in the self folding propensity of CsgB which we could show to be the major rate limiting step during the nucleation of CsgA. These results present the first sequence-specific data of structural elements of CsgB fibrils and provide a closer picture of the nucleation process at a structural level in curli biogenesis.

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Nagaraj, Madhu: Structural Analysis of Nucleation Mechanism in Curli Biogenesis using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 2012.

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