Generation of Recombinant Designer Antibodies Using Phage Display for a Rapid and Subtype Specific InfluenzaDetection System

Mersmann, Jana ORCID

Influenza A/H5N1-Viren haben in der Vergangenheit verschiedene Pandemien verursacht. Diese humanpathogenen Viren aviären Ursprungs können durch genetische Veränderungen Artbarrieren überwinden. Für H5N1 besteht ein dringender Bedarf an Breitspektrum-Diagnostika. Ziel dieser Arbeit war es, H5-spezifische Antikörper zu identifizieren, die in einem subtypspezfischen System zum Nachweis und zur Unterscheidung von Influenzaviren anderen Subtypes eingesetzt werden können. Nach Vakzinierung von Hühnern mit aviären H5N1-Viren aus phylogenetisch entfernten „Clades“ wurden in dieser Arbeit zwei (scFv) Phage-Display Antikörperbibliotheken hergestellt. Zur Selektion der Antikörper wurden zwei zusätzliche rekombinante H5-Antigene verwendet. Es wurden 12 unterschiedliche H5 spezifisch scFv-Fragmente isoliert und in Säugerzellen als bivalente IgG-ähnliche Antikörper (scFv-Fc-Format) exprimiert. Alle scFv-Fc-Antikörper binden beide H5-Antigene im Immunoblot und im ELISA. Kreuzreaktivität mit weiteren Proteinen zeigte sich nicht. Die Mehrheit der selektierten Binder erkannte eine große Bandbreite an H5-Viren und zeigte keine Kreuzreaktivität mit anderen eng verwandten Influenzaviren anderer HA-Subtypen. Ein Antikörper wies eine sehr breite Bindungsspezifität für H5. Zwei Antikörper zeigten neutralisierende Aktivität. Die Epitop-Analyse auf membrangebundenen Peptiden führte zur Aufklärung eines 6-Aminosäure kurzen, innerhalb der H5-Influenzaviren hoch konservierten, Epitops. Im H5-Sandwich-ELISA und einem membranbasierten Immuno-Dotblot-Assay konnte gezeigt werden, dass mit den isoierten Antikörpern der Aufbau eines schnellen diagnostischen Tests möglich ist. Im Elektronenmikroskop konnte die spezifische Bindung der Antikörper an die Virusoberfläche gezeigt werden. Somit führte eine erfolgreiche Immunisierungs- und Selektionsstrategie zur Isolierung mehrerer H5-spezifischer Antikörper und zur Aufdeckung eines hoch konservierten linearen, für H5-Influenzaviren spezifischen Epitopes.

Influenza A/H5N1 viruses caused several panzootic outbreaks in the past. These viruses of avian origin have acquired a zoonotic potential by genetic changes and can cross species barriers including humans. There is an urgent need of reliable broad spectrum H5N1 diagnostics. The aim of this work is to identify H5 specific antibodies applicable in a subtype specific diagnostic detection and discrimination system for influenza viruses. Two single chain (sc)Fv antibody gene phage libraries were generated from chickens vaccinated and challenged with avian H5N1 influenza viruses from phylogenetically distant clades. For antibody selection two additional recombinant H5 antigens were applied. Twelve unique anti-H5 scFvs were isolated expressed in mammalian cells. All of them showed binding to H5 hemagglutinin proteins in ELISA and immunoblot assays without cross-reactivity with unrelated proteins. The majority of selected binders detected a large variety of H5 viruses in immunoperoxidase monolayer assays (IPMA) and showed no cross-reactivity with other influenza viruses of closely related HA-subtypes. For one antibody very broad binding specificity for H5 antigens from different strains and for two antibodies neutralizing activity was demonstrated. Epitope mapping revealed a six amino acid short epitope highly conserved among H5 influenza viruses. In H5 sandwich ELISA and membrane based immunodot blot assays the proof of principle of a rapid diagnostic assay,was demonstrated. Antibodies specifically stained influenza viruses of an H5 strain in electron microscopy. Thus, a successful immunization and selection strategy comprising four different H5 sources leading to several H5 specific antibodies and elucidating a highly conserved linear epitope specific for H5 influenza viruses has been demonstrated. Isolated antibodies and the highly conserved linear epitope in the H5 HA1 domain can be used in different applications e.g. influenza diagnostics, therapy and vaccination.

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Mersmann, Jana: Generation of Recombinant Designer Antibodies Using Phage Display for a Rapid and Subtype Specific InfluenzaDetection System. 2012.

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