Identifikation einer neuen WRKY-Transkriptionsfaktorbindungsstelle in bioinformatisch identifizierten, Pathogen-responsiven cis-Elementen aus Arabidopsis thaliana

Machens, Fabian

Pflanzen sind einer Vielzahl von Phytopathogenen ausgesetzt und besitzen komplexe Resistenz-und Abwehrmechanismen. Ein wichtiger Bestandteil der Pathogenabwehr ist die massive transkriptionelle Reprogrammierung. Dafür sind unter anderem Transkriptionsfaktorbindungsstellen (TFBS) in den Promotoren der Zielgene unverzichtbar. Bioinformatische Analysen haben in der Vergangenheit zur Identifikation neuer potentieller TFBS in Pathogen-responsiven Promotoren aus A. thaliana geführt. Viele dieser cis-Sequenzen können als synthetische Promotoren in Petersilie-Protoplasten eine Responsivität auf das MAMP (microbe-associated molecular pattern) Pep25 vermitteln. Zwei Sequenzen aus einer Gruppe Pep25-responsiver Sequenzen mit einer hoch konservierten [T/G]ACTTTT-Kernsequenz wurden in der vorliegenden Arbeit näher analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass in beiden Sequenzen die Kernsequenz und weitere benachbarte Nukleotide unverzichtbar für die Pep25-Responsivität sind. Untersuchungen an transgenen A. thaliana-Linien belegen, dass beide Sequenzen eine Responsivität auf Infektion mit Botrytis cinerea vermitteln. Yeast One-Hybrid-Screenings und Transaktivierungsassays in Protoplasten führten zur Identifizierung von WRKY70 als Aktivator der untersuchten Sequenzen. WRKY70 kann zwar die beiden hier untersuchten cis-Sequenzen transaktivieren, eine TFBS und die direkte in vitro Interaktion konnte aber nur mit einer der Sequenzen gezeigt werden. Die identifizierte TFBS hat die für WRKY-Faktoren untypische Sequenz CGACTTTT. Mutationen innerhalb der TFBS führen zum Verlust der Pep25-Responsivität, der Transaktivierbarkeit und der Bindung durch WRYK70. Bindungsstudien mit weiteren eng verwandten Pep25-responsiven Sequenzen legen nahe, dass die Konsensussequenz der WRKY70-TFBS als YGACTTTT beschrieben werden kann. Bioinformatische Analysen zeigen, dass diese Sequenz in WRKY70-induzierten Genen angereichert ist und dass potentielle WRKY70-Zielgene in die Pathogenantwort involviert sind.

Plants have evolved complex resistance mechanisms to facilitate disease resistance. A major part of these mechanisms is transcriptional induction of defense genes. This requires the presence of defined transcription factor binding sites (TFBS) in target gene promoters. Recently, bioinformatic analyses led to the identification of potential TFBS in pathogen-responsive promoters from Arabidopsis thaliana. When used as synthetic promoters in parsley protoplasts, many of these cis-regulatory elements confer responsiveness toward the microbe-associated molecular pattern (MAMP) Pep25. Two of these cis-elements, belonging to a group of Pep25-responsive sequences with a highly conserved [T/G]ACTTTT core, have been analyzed in the present work. Mutational analyses revealed that the conserved core in both sequences is indispensable for Pep25-responsivness. However, in both sequences nucleotides adjacent to the core sequence are also essential for induction by Pep25. Pathogen infections of transgenic A. thaliana demonstrate that both sequences mediate responsiveness toward infection with Botrytis cinerea. WRKY70 was identified as transcriptional activator for both sequences using yeast one-hybrid screening and trans-activation assays in protoplasts. Both sequences investigated in the present work are trans-activated by WRKY70. A direct in vitro interaction between WRKY70 and a TFBS within the bioinformatically identified sequence occurs only with one of the two sequences. The WRKY70 TFBS (CGACTTTT) identified in this work is atypical for WRKY TFs. Mutations within this TFBS abolish trans-activation and binding of WRKY70. In vitro binding studies with closely related Pep25-responsive sequences suggest a YGACTTTT consensus sequence for the WRKY70 TFBS: Bioinformatic analyses demonstrate enrichment of this consensus sequence in WRKY70-induced gene promoters and suggest a role in defense responses for potential WRKY70 target genes.

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Machens, Fabian: Identifikation einer neuen WRKY-Transkriptionsfaktorbindungsstelle in bioinformatisch identifizierten, Pathogen-responsiven cis-Elementen aus Arabidopsis thaliana. 2013.

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