Functional Studies on the Histidine Kinase CaNik1p from Candida albicans

Elmowafy, Mohammed Asaad Zaky Hassan

CaNik1p ist eine Histidinkinase (HK) der Gruppe III aus dem humanpathogenen Pilz Candida albicans. Die Relevanz dieser Enzymgruppe für die Wirkung von Fungiziden wurde durch die Herstellung von Saccharomyces cerevisiae – Transformanten gezeigt, in denen CaNik1p und andere Gruppe III HKs exprimiert wurden. Um die Rolle von verschiedenen Domänen von CaNik1p für die fungizide Wirkung zu untersuchen, wurden Punktmutationen in den konservierten Domänen HisKA, HATPase_c und REC eingeführt. Mit dem rekombinant hergestellten, aufgereinigten Protein CaNik1p konnten wir diese Wechselwirkung mit dem Wirkstoff Fludioxonil über Sättigungstransferdifferenz-NMR erstmals zeigen. Außerdem erwiesen sich die Transformanten, die die mutierten Proteine exprimierten, als resistent gegen die Fungizide. Die Sensitivität gegenüber Fungiziden korrelierte mit dem Phosphorylierungszustandder MAP kinase Hog1p nach Behandlung mit Fludioxonil. Fludioxonil inhibierte jedoch die Kinaseaktivität des Proteins nicht, wie wir durch In-vitro Kinaseaktivitätstests mit dem gereinigten Protein zeigen konnten. Die Kinaseaktivität konnte selbst in den Proteinmutanten noch nachgewiesen werden. Gruppe III HK sind durch eine Abfolge von HAMP Domänen im N-terminalen Bereich der Proteine charakterisiert. Da die Funktion dieser Domänen noch weitgehend unverstanden ist, entfernten wir sie aus dem Protein. Die Expression dieses verkürzten Proteins CaNik1pDHAMP führte zur Wachstumshemmung der S. cerevisiae-Transformante, was mit der konstitutiven Phosphorylierung von Hog1 korrelierte.Durch zusätzliche Punktmutation in der HisKA-Domäne(H510Q) oder durch Expression in S. cerevisiae Mutanten, in denen einzelne Gene des HOG-Signalweges deletiert waren, konnte dieser Effekt aufgehoben werden. Die Behandlung mit Fungiziden und die Deletion der HAMP Domänen führten zur Reduktion des Wachstums, für die die Funktionalität der konservierten Proteindomänen essentiell war.

CaNik1p is a group III HK of the most frequent human fungal pathogen Candida albicans. The relevance of this group of enzymes for fungicidal activity was shown by the construction of Saccharomyces cerevisiae transformants, in which CaNik1p and other group III HKs were expressed. To investigate the role of different domains of CaNik1p for fungicidal activity, wild-type and mutated variants of CaNIK1 were constructed and heterologously expressed in S. cerevisiae. We could show for the first time a direct interaction between fludioxonil and CaNik1p, an example of group III HKs. The yeast strains, which expressed variants of the protein, which were mutated in the conserved HisKA, HATPase_c and REC domains, showed complete loss of sensitivity against the tested antifungals. The sensitivity to antifungals correlated with the phosphorylation state of the MAP kinase Hog1p after treatment with fludioxonil. However, fludioxonil did not interfere with the histidine kinase activity of the protein as revealed from in vitro kinase assays using the purified protein and monitoring ATP consumption or autophosphorylation of the protein. Group III HKs are characterized by consecutive HAMP domains in the N-terminal part of the protein. As the function of these domains is largely unknown, we deleted them from the protein. Expression of CaNik1p?HAMP led to growth inhibition of the transformed S. cerevisiae that correlated with constitutive phosphorylation of Hog1p. This could be reversed by additional point mutation in the conserved His510 of the HisKA domain or by expression in S. cerevisiae single gene deletion mutants of the response regulator SSK1 or one of the components of theHog1MAPK module. In conclusion, treatment with antifungals and deletion of HAMP domains led to severe growth inhibition, which correlated with the activation of the MAP kinase Hog1, and for which the functionalities of the conserved domainsof the HK CaNik1p were essential.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Elmowafy, Mohammed Asaad Zaky Hassan: Functional Studies on the Histidine Kinase CaNik1p from Candida albicans. 2013.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export