Die funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Transkriptionsregulators AlsR aus Bacillus subtilis

Frädrich, Claudia

Der Transkriptionsregulator AlsR aus B. subtilis, welcher zu der Familie der LysR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren zählt, reguliert die Expression des alsSD-Operons, dessen Produkte für die Enzyme der Acetoinbiosynthese codieren. In dieser Arbeit konnte durch Mutationsanalysen Aminosäurereste identifiziert werden, welche für die Bindung des Effektormoleküls verantwortlich sind. Hierzu zählt unter anderem der Aminosäurerest Serin an Position 100, der nach Austausch zu Alanin in vivo zu einem inaktiven AlsR Protein führt. Des Weiteren führt diese Mutation zu einem Defekt in der Komplexbildung, der in vitro durch Gelretardationsanalysen nachgewiesen wurde. Eine Deletion von 5 bp zwischen der regulatorischen und der aktivierenden AlsR Erkennungssequenz im alsSD Promotor führte zu einem Verlust der in vivo Aktivität und weist ebenfalls einen Defekt in der Komplexbildung bei der Gelretardationsanalyse auf. Durch Mutationsanalysen und Gelretardationsanalysen konnten Aminosäurereste in der Helix 2 sowie in der Helix 3 im Helix-Turn-Helix-Motiv des B. subtilis AlsR identifiziert werden, die essentiell für die Bindung an den alsSD-Promotor sind. Durch Mutationsanalysen, Gelretardationsanalysen und Biegungsexperimente wurde der Einfluss der Oligomerisierung auf die transkriptionelle Aktivierung bestimmte. Der Austausch des Aminosäurerests L124A führt in vivo zu keiner Expression des alsSD-Promotors. Jedoch zeigte diese Mutante in der Gelretardationsanalyse keinen Einfluss auf die Komplexbildung am alsSD Promotor. DNA-Biegungsexperimente hingegen zeigten, dass das AlsRL124A Protein nicht mehr in der Lage ist, den alsSD-Promotor zu biegen. Die transkriptionelle Aktivierung durch AlsR wird durch die Effektorbindung, die spezifische Bindung des Regulators an den alsSD-Promotor, AlsR Oligomerisierung und die Biegung der DNA beeinflusst. Die Ergebnisse dieser Dissertation führten zur Entwicklung eines Modells der AlsR-abhängigen transkriptionelle Aktivierung.

The transcriptional regulator AlsR of B. subtilis belongs to the family of LysR-type transcriptional regulators, regulate the expression of the alsSD operon encoding enzymes for the acetoin biosynthesis. In this thesis, amino acid residues, which are responsible for the binding of the effector molecule, could be identified via mutational analysis. This includes the amino acid residue serine at position 100, which after exchange to alanine resulted in an inactive AlsR protein. Furthermore, this mutation led to a defect in complex formation, which has been shown by in vitro experiments via EMSA. Deletion of 5 bp between the RBS and ABS binding site of AlsR in the alsSD-promoter resulted in a complete lost of in vivo activity. In addition, the deletion of 5 bp led also to a defect in complex formation in EMSA. Furthermore, amino acids residues in helix a2 and helix a3 of the helix-turn-helix motif of B. subtilis AlsR were identified which are essential for binding at the alsSD-promoter. Via mutational analysis, EMSA and bending-experiments the influence of oligomerization in the transcriptional activation was determined. The exchange of the amino acid residue L124 to alanine led to an inactive AlsR protein. Nevertheless, this mutant protein had no influence in complex formation at the alsSD-promoter. In bending experiments, AlsRL124A was not able to bend the alsSD-promoter. The transcriptional activation of AlsR was affected by effector binding, specific binding of the regulator to alsSD-promoter, AlsR oligomerization and bending of the DNA. The results of this thesis led to the development of a model of AlsR-dependent transcriptional activation.

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Frädrich, Claudia: Die funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Transkriptionsregulators AlsR aus Bacillus subtilis. 2013.

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