Time-resolved characterization of the HGF/Met response and the influence of L. monocytogenes InlB on the physiological phosphoproteome

Berger, Evelin

Die von Vertebraten exprimierte Rezeptor-Tyrosin-Kinase Met wird durch die Bindung des physiologischen Wachstumsfaktors HGF aktiviert. Dies steuert Proliferation, Überleben, Motilität und Angiogenese; Prozesse, die besonders wichtig während der Embryonalentwicklung und Wundheilung sind. Dereguliert kann HGF/Met allerdings die Metastasierung von Krebszellen unterstützen. Darüber hinaus nutzt das Pathogen Listeria monocytogenes den Met-Rezeptor als Eintrittspforte. Dabei bindet und aktiviert dessen Oberflächenprotein Internalin B (InlB) den Met-Rezeptor und induziert dadurch die Invasion des Bakteriums. Da HGF und InlB unterschiedliche Regionen an Met binden und die von ihnen ausgelösten Prozesse sehr unterschiedlich sind, war das Ziel dieser Arbeit der Vergleich der Signalwege nach Stimulation von humanen Zelllinien mit beiden Liganden. Quantitative Phosphoproteomik wurde verwendet, um den physiologischen Signalweg zeitaufgelöst innerhalb der ersten 20 Minuten nach HGF-Zugabe zu studieren. Etwa 8000 Phosphorylierungsstellen wurden identifiziert, wovon 95 an 80 Proteinen im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle signifikant reguliert waren. 40 davon sind neue HGF/Met-Signalkomponenten, da sie entweder mit etablierten Bestandteilen interagieren oder Prozesse steuern, die durch HGF/Met induziert werden. Durch Knockdown und Genexpressionsanalyse wurde die Rolle von zwei Proteinen detaillierter untersucht. Der EPHA2-Rezeptor kontrolliert HGF-induzierte Genexpression durch eine Rückkopplungsschleife. Die NEK9-Kinase war in der Mitose beschrieben, reguliert aber HGF-abhängig keine Proliferation. Stattdessen beeinflusst sie Motilität in üblicherweise nicht-motilen Zellen. Der Vergleich des HGF- und des InlB-Phosphoproteoms zeigte gemeinsam genutzte Signalkomponenten. Jedoch waren 10-15 Proteine HGF- bzw. InlB-spezifisch und könnten den Unterschied zwischen der zellulären Antworten bezüglich Regeneration und bakterieller Invasion erklären.

The vertebrate receptor tyrosine kinase Met is bound and activated by its physiological ligand hepatocyte growth factor (HGF). This interaction regulates proliferation, survival, motility, and angiogenesis in cells and plays an important role during embryogenesis and wound healing. However, HGF/Met is often deregulated in cancer which promotes metastasis. Furthermore, the Met receptor is exploited by the facultative intracellular human pathogen Listeria monocytogenes. This bacterium activates the Met receptor through binding with its surface protein internalin B (InlB), a process that induces the uptake of the pathogen into its host cell. Since HGF and InlB bind to Met at different sites and the cellular responses are clearly different, this thesis aimed to compare the signal transduction pathways downstream of the Met receptor induced by both ligands in human cell lines. Quantitative phosphoproteomics was used to characterize the physiologic Met signaling over a time course in the first 20 minutes after stimulation with HGF. About 8000 phosphorylation sites were identified, with 95 belonging to 80 proteins being significantly regulated compared to the non-stimulated control. 40 proteins of them are likely new Met pathway members, because they interact with established components or are involved in cellular responses known for HGF/Met. Two of them were characterized in detail by knockdown and gene expression analysis. The EPHA2 receptor is involved in a feedback loop controlling HGF-induced gene expression. The kinase NEK9 was described in mitosis, but does not affect HGF-induced proliferation. In contrast, it regulates motility in usually non-motile cells. Comparing the HGF/Met phosphoproteome to signaling triggered by pathogenic InlB revealed downstream pathway members activated by both ligands. Importantly however, around 10-15 proteins were HGF- or InlB-specific and could make the difference between tissue regeneration and bacterial invasion.

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Berger, Evelin: Time-resolved characterization of the HGF/Met response and the influence of L. monocytogenes InlB on the physiological phosphoproteome. 2013.

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