Etablierung einer neuen Methode zur gerichteten Sequenzierung im Next Generation Sequencing von cDNA-Banken

Knaust, Florian Erich

Um DNA mittels 454-Technologie sequenzieren zu können, muss sie von Adaptersequenzen flankiert sein. Diese werden entweder über Random-Ligation eingeführt, oder mittels PCR heranamplifiziert (454-Amplicon-Library). Letzteres ermöglicht als einziges eine gerichtete Sequenzierung Target-spezifischer Bereiche. Die Herstellung einer 454-Amplicon Library nach bestehenden Protokollen hat einige Mängel: (i) die Adaptersequenzen werden als bis zu 40 Basenpaar lange Overhangs an den 5‘-Enden der Primer eingeführt; (ii) die Primer können Längen von über 60 Basenpaare haben; (iii) die Adaptersequenzen selber können inkompatibel mit Target-spezifischen Sequenzen sein. In dieser Arbeit wurden neue Protokolle zur gerichteten Sequenzierung entwickelt, die auch dann erfolgreich anwendbar sind, wenn bestehende Protokolle scheitern. Die entwickelte Methodik beruht auf gerichteter Ligation von 454-Adaptersequenzen über die Verwendung von unterschiedlichen SfiI-Restriktions-Schnittstellen. Diese können während der cDNA-Synthese in das Template eingeführt, oder unabhängig davon mittels PCR als kurze Overhangs heranamplifiziert werden. Template- und 454-Library-Produktion wurden entkoppelt, wodurch man unabhängig von Template-Sequenzen und verwendeten Primern ist. Die Gestaltung von Multiplex-Runs ist flexibler und die MID-Wahl kann zeitnah durchgeführt werden. Die Sequenzierrichtung kann frei gewählt werden, womit eine optimale Anpassung an biologische Fragestellungen und effektive Ausnutzung der PTP ermöglicht wird. Das Protokoll ist leicht adaptierbar und funktioniert prinzipiell mit jeglichem Template. Aufreinigungs- und Größenselektionsschritte garantieren eine hohe Qualität. Die benötigten Template-Mengen konnten gemessen an den Standard-Protokollen auf weniger als ein Zehntel reduziert werden; 10 ng DNA sind ausreichend. Es wurden erfolgreiche 454-Sequenzier-Läufe von cDNAs und einer Illumina-Library durchgeführt, außerdem wurde ein Deepsequencing von IgH-cDNAs ermöglicht.

To be able to sequence DNA with 454-technology, the DNA has to be flanked by adapter-sequences. Those can be introduced by random ligation, or added by PCR (454-amplicon library). Only the latter enables directed sequencing of target-specific areas. 454-amplicon library-generation following Roche’s protocol has some flaws: (i) the adapter-sequences are added as up to 40 base-pair long overhangs at the 5’-ends of primers; (ii) the primers have lengths of over 60 base-pairs overall and (iii) the adaptor-sequences themselves may be incompatible with the target-specific sequences. The outcome of this work are novel protocols for 454-sequencing, which can be successfully applied to templates where sequencing utilizing existing 454-protocols failed. The method developed is based on directed ligation of 454 adapter-sequences by using different SfiI-restriction-sites of the template-DNA. These can be introduced into the template during cDNA-synthesis, or independently as short overhangs by PCR. Template- and 454-library-production-steps are uncoupled and 454-library-production becomes independent of template-sequences and –primers. The design of multiplex-runs becomes more flexible and assignment of MIDs may be done contemporary. Orientation of sequencing direction can be chosen freely, offering optimal adaptation to any biological question and an effective exploitation of PTP-space. The protocol is easily adaptable and works with any template in principle. Purification- and size-selection-steps are performed to guarantee high quality of the library-DNA. The amount of template needed could be reduced to less than a tenth compared to standard protocols; 10 ng of DNA is sufficient.Successful 454-sequencing-runs of cDNA-libraries and an Illumina-library were performed, and also deepsequencing of IgH-cDNAs was made possible.

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Knaust, Florian Erich: Etablierung einer neuen Methode zur gerichteten Sequenzierung im Next Generation Sequencing von cDNA-Banken. 2013.

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