Entwicklung einer membranchromatographischen Methode zur Isolierung von Anthocyanen aus Heidelbeeren und weiteren Früchten

Juadjur, Andreas

Es wurde eine HPLC-Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Heidelbeerpolyphenolen entwickelt. Mit dieser Methode erfolgte die Analytik von frischen und behandelten Heidelbeerproben, Heidelbeerprodukten und verkapselten Heidelbeerinhaltsstoffen sowie eines kommerziell erhältlichen Heidelbeerextraktes. Der Heidelbeerextrakt zeigte im Gegensatz zu den weiteren Heidelbeerprodukten während einer zweijährigen Lagerperiode bei Kühllagerung (-18°C) und bei Raumtemperatur (25°C), unter Feuchtigkeits-, Licht- und Sauerstoff-Ausschluss, keine Veränderung im Anthocyanprofil, Gesamtanthocyangehalt (27,6%), Gesamtpolyphenolgehalt (53,5%, Folin-Ciocalteu) sowie der antioxidativen Aktivität (3540 µmol/g, TEAC). Ein Screening frischer Heidelbeerproben aus Deutschland zeigte keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anthocyanprofile und gehalte in unterschiedlichen deutschen Regionen. Durch den Vergleich der Anthocyanprofile von frischen Heidelbeeren mit kommerziellen und im Labormaßstab hergestellten Extrakten konnte die Authentizität der Extrakte sowie eine schonende Herstellungsweise sichergestellt werden. Zur Klärung möglicher synergistischer Effekte der bioaktiven Komponenten des Heidelbeerextraktes wurde dieser in die drei Inhaltsstoffgruppen Anthocyane, Copigmente und Polymere mittels High-Speed-Countercurrent-Chromatographie (HSCCC) aufgetrennt. Zur vollständigen und TFA-rückstandsfreien Fraktionierung des Extraktes wurde eine membranchromatographische Methode entwickelt und erfolgreich eingesetzt. Mittels dieser Methode sowie der eingesetzten Kationenaustauschermembran gelang es, 99,8% der im Extrakt enthaltenen Anthocyane zu isolieren und als hochreine Anthocyanfraktion zu gewinnen. Im Labormaßstab ließ sich die membranchromatographische Methode neben der Heidelbeere auch auf weitere anthocyanhaltige Früchte und Extrakte, wie z.B. Brombeeren, Cranberry, Granatapfel und Hibiskus übertragen, so dass erstmals eine neuartige Methode zur vollständigen Isolierung von Anthocyanen aus anthocyanhaltigen Früchten zur Verfügung stand, die vollständig auf giftige Lösungsmittel und Reagenzien verzichtet. Nach Abtrennung der Anthocyane war es erstmals möglich, hochreine Anthocyan-, Polymer- und Copigmentfraktionen im präparativen Maßstab zu isolieren und diese Fraktionen zu Verkapselungszwecken sowie für biologische Studien und Testungen zur Verfügung zu stellen. In den verschiedenen in vitro-Testsystemen zeigte vor allem die Copigmentfraktion hohe Aktivitäten und positive Effekte auf die untersuchten Biomarker in Caco-2-Zellen (Darmkrebszellen). Aufgrund dieser Aktivitäten wurde auch die Copigmentfraktion detailliert untersucht. Es konnten neben Quercetin und Chlorogensäure (5-CQA) als Hauptkomponenten unter den Copigmenten, durch Anreicherung mittels LSRCCC und weitere Trennungen mittels HSCCC, erstmals 3 neue Verbindungen aus einem Heidelbeerextrakt isoliert und mittels NMR-Spektroskopie strukturell aufgeklärt werden. Ein weiterer wichtiger Punkt war die Erfassung und Isolierung der wertgebenden Komponenten des bei der Saftherstellung anfallenden Heidelbeertresters. Dabei konnte gezeigt werden, dass unter den lipophilen Inhaltsstoffen hauptsächlich Triglyceride sowie einige bioaktive Minorkomponenten, darunter z.B. β-Amyrin, β-Sitosterol oder Oleanolsäure, enthalten sind. Außerdem ließen sich durch Kombination der entwickelten membranchromatographischen Methode mit der methanolischen Extraktion und Abtrennung der lipophilen und semipolaren Komponenten 2,6 g einer hochreinen Anthocyanfraktion aus insgesamt 120 g gefriergetrocknetem Trester gewinnen.

A HPLC method for the characterization and quantification of bilberry polyphenols was developed. This method was used for the analysis of fresh and treated bilberry samples, bilberry products, encapsulated bilberry constituents and commercially available bilberry extracts. The bilberry extract showed, in contrast to the other bilberry products, during a two year period of cold storage (-18 ° C) and storage at room temperature (25 ° C), with exclusion of humidity, light and oxygen, no change in the anthocyanin profile, total anthocyanin content (27,6%), total polyphenolic content (53.5%, Folin-Ciocalteu) and the antioxidant activity (3540 µmol/g, TEAC). A screening of fresh bilberry samples showed no significant differences in the anthocyanin profiles and contents in the different regions of Germany. By comparing the anthocyanin profile of fresh bilberries with commercial extracts and self-prepared extracts in laboratory-scale, the authenticity of the extracts as well as a gentle way of production could be guaranteed. To clarify possible synergistic effects under the bioactive components of the bilberry, the extract was separated into three groups of constituents, anthocyanins, copigments and polymers by using high-speed countercurrent chromatography (HSCCC). For complete and TFA-residue-free fractionation of the extract, a membrane chromatographic method was developed and used successfully. By using this method with a cation exchange membrane, it was possible to isolate 99.8% of the contained anthocyanins from the extract and to win as a highly purified anthocyanin fraction. In laboratory scale, the membrane chromatographic method could be transferred from blueberry to other anthocyanin containing fruits and extracts such as blackberry, cranberry, pomegranate and hibiscus. Thus, for the first time, a novel method for total isolation of anthocyanins from anthocyanin containing fruits was available which completely dispensed with toxic solvents and reagents. After separation of anthocyanins, it was possible for the first time to isolate high purity anthocyanin, polymer and copigment fractions on a preparative scale, in order to provide these fractions for encapsulation purposes as well as for biological studies and tests. In various in vitro test systems, especially the copigment fraction showed high activities and positive effects on the studied biomarkers in Caco-2 cells (cancer cells). Due to this activity, the copigment fraction was also investigated in detail. Besides quercetin and chlorogenic acid (5-CQA) as main components amongst the bilberry copigments, for the first time three novel compounds could be isolated from a bilberry extract by enrichment with LSRCCC and additional separations using HSCCC as well as confirmed by NMR spectroscopy. Another important point was the detection and isolation of the value-adding components of the resulting pomace in bilberry juice production. It could be shown that amongst the lipophilic substances primarily triglycerides are contained and some bioactive minor components like β-amyrin, β-sitosterol and oleanolic acid are included. Also 2.6 g of a high purity anthocyanin fraction could be obtained from a total of 120 g of freeze-dried pomace by combining the developed membrane chromatographic method with methanol extraction and partitioning of the lipophilic and semi polar components.

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Juadjur, Andreas: Entwicklung einer membranchromatographischen Methode zur Isolierung von Anthocyanen aus Heidelbeeren und weiteren Früchten. 2012.

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