Evolution spezifizierender Proteine der Ordnung Brassicales

Kuchernig, Jennifer-Christin

Das Glucosinolat-Myrosinase-System ist ein pflanzliches Abwehrsystem der Brassicales. Spezifizierende Proteine sind Teil dieses aktivierten chemischen Abwehrsystems. Bei Gewebeverletzung kommt es zur Hydrolyse der Glucosinolate durch Myrosinasen. Die entstehenden Hydrolyseprodukte lagern sich entweder spontan in toxische, als Abwehrstoffe dienende Isothiocyanate um oder werden durch spezifizierende Proteine in Epithionitrile, einfache Nitrile oder organische Thiocyanate mit weitgehend unbekannter biologischer Funktion umgewandelt. Ziel dieser Arbeit war die Klonierung, Charakterisierung und phylogenetische Analyse spezifizierender Proteine unterschiedlicher Produktspezifität. Durch ein phytochemisches Screening konnten von Isothiocyanaten abweichende Hydrolyseprodukte in 14 Spezies der Brassicaceae sowie in einer Spezies der Tropaeolaceae nachgewiesen werden. Ergänzend zu acht bekannten spezifizierenden Proteinen konnten Full-length cDNAs von drei NSPs, sechs ESPs und zwei TFPs isoliert und die codierten Proteine biochemisch charakterisiert werden. Für die phylogenetischen Analysen standen unter Einbeziehung von drei einer Datenbankrecherche entnommenen und nicht charakterisierten Proteinen 22 Full-length cDNAs und die homologe Sequenz At3g07720 aus A. thaliana zur Verfügung. Die phylogenetischen Stammbäume wurden auf Basis von Nukleotid? und Aminosäuresequenzen mittels verschiedener Verfahren erstellt. Die grundlegend identische Topologie der ermittelten phylogenetischen Stammbäume sowie die Berechnungen von Datenmatritzen für Sequenzdivergenzen und -identitäten als Maß evolutionärer Distanz und die strukturellen Merkmale der spezifizierenden Proteine bestätigen At3g07720 als Vertreter einer Gruppe von Vorläuferproteinen der spezifizierenden Proteine. Ausgehend von At3g07720 und homologen Sequenzen entwickelten sich die NSPs des AtNSP5-Clusters. Eine Aufsplittung dieser NSPs führte zu den NSPs des AtNSP1-Clusters. Eine Duplikation der NSPs des AtNSP1-Clusters führte dann zu den ESPs des ESP/TFP-Clusters. Die Auffächerung der ESPs konnte auf einen Zeitpunkt nach der Auffächerung der Kerngruppe der Brassicaceae in die Abstammungslinien I und II geschätzt und die vorausgehende Genduplikation auf ein Alter von mindestens 35,6 Mill. Jahre datiert werden. Die weitere Evolution ergab eine zweifach unabhängige Entstehung von TFPs ausgehend von ESPs, welche nach der Auffächerung der Kerngruppe der Brassicaceae in die Abstammungslinien stattgefunden haben muss.

The glucosinolate-myrosinase system of the Brassicales is a plant defense system. Specifier proteins are part of this activated chemical defense system. Upon tissue disruption glucosinolates are hydrolysed by myrosinases. The arising hydrolysis products rearrange spontaneously to form toxic isothiocyanates which serve as defense compounds. In the presence of specifier proteins, epithionitriles, simple nitriles or organic thiocyanates are formed. The biological activity of the alternative products is largely unknown. The aim of this work was the cloning, characterisation and pyhlogenetic analyses of specifier proteins with different product specificities. Based on a phytochemical screening it was possible to detect hydrolyses products others than isothiocyanates in 14áspecies of the Brassicaceae and in one species of the Tropaeolaceae. Additional to the eight already known specifier proteins it was possible to isolate full-length cDNAs of three NSPs, six ESPs and two TFPs and to biochemically characterize the corresponding proteins.For the phylogenetic analyses of the specifier proteins and with comprehension of three not characterized proteins identified in a database, it was possible to include 22 full-length cDNAs and the homologous sequence At3g07720 from A. thaliana. The phylogenetic trees were calculated based on nucleotide and amino acid sequences using different methods. The obtained basal topology was identical for all investigated phylogenetic trees and together with the estimated data for sequence divergences and sequence identities as a measurement for evolutionary distances as well as together with the structural features of the specifier proteins it was possible to confirm At3g07720 as a member of a group of ancestral proteins. Based on At3g07720 and homologs the NSPs of the AtNSP5-cluster have evolved. A split of these NSPs lead to the NSPs of the NSP1-cluster. A following duplication of NSPs of the AtNSP1-cluster caused the ESPs and TFPs of the ESP/TFP-cluster. The expansion of ESPs could be estimated to a point in time after the expansion of the core group of the Brassicaceae in lineage I and lineage II and the preliminary gene duplication could be estimated to date back to at least 35,6 million years ago. The further evolution yielded to a twice independent genesis of TFPs from ESPs which could be dated after the expansion of the core group of the family Brassicaceae in the two lineages I and II.

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Kuchernig, Jennifer-Christin: Evolution spezifizierender Proteine der Ordnung Brassicales. 2012.

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